Екі тізбекті РНҚ (dsRNA) ELISA KIT

Бұл жинақ биотин-стрептавидин жүйесі бар ферментпен байланысты иммуносорбентті талдау (ELISA) қосылымы болып табылады, дәйектілігіне қарамастан ұзындығы 60 негізгі жұптан (bp) асатын dsRNA сандық өлшеуге арналған.Пластина анти-dsRNA антиденелерімен алдын ала қапталған.Үлгіде бар dsRNA қосылады және ұңғымалармен қапталған антиденелермен байланысады.Содан кейін биотинленген анти-dsRNA антиденесі қосылады және үлгідегі dsRNA-мен байланысады.Жуғаннан кейін HRP-стрептавидин қосылады және биотинленген анти-dsRNA антиденелерімен байланысады.Инкубациядан кейін байланыспаған HRP-стрептавидин жуылады.Содан кейін TMB субстрат ерітіндісі қосылады және қышқыл тоқтату ерітіндісін қосқаннан кейін сарыға өзгерген көк түсті өнім алу үшін HRP арқылы катализденеді.Сары түстің тығыздығы пластинада түсірілген dsRNA мақсатты мөлшеріне пропорционал.Сіңіру 450 нм-де өлшенеді.

Қолдану

Бұл жинақ қалдық dsRNA сандық өлшеуге арналған.

Жинақтың құрамдас бөліктері

Сақтау және тұрақтылық

1. Пайдаланылмаған жинақ үшін: бүкіл жинақты сақтау мерзімінде 2~8℃ температурада сақтауға болады.Сақтау тұрақтылығы үшін күшті жарықтан аулақ болу керек.

2. Пайдаланылған жинақ үшін: Микропластинаны ашқаннан кейін, пайдаланылмаған ұңғымаларды пластина тығыздағышпен жабыңыз және кептіргіш пакеті бар фольга дорбасына оралыңыз, фольга қалтасын сыдырмамен жабыңыз және қолданғаннан кейін мүмкіндігінше тезірек 2~8℃ температурасына оралыңыз.Басқа реагенттерді қолданғаннан кейін мүмкіндігінше тезірек 2~8℃ температурасына қайтару керек.

Қажетті, бірақ жеткізілмеген материалдар

1. 450±10 нм сүзгісі бар микропластинаны оқу құрылғысы (450 және 650 нм толқын ұзындығында анықтай алатын болса жақсы).

2. Микропластиналық шайқағыш.

3. RNase жоқ ұштары мен центрифуга түтіктері.

Операциялық блок-схема

Сен бастамас бұрын

1. Қолданар алдында жинақтың барлық компоненттері мен үлгілерін бөлме температурасына (18-25℃) жеткізіңіз.Жинақ бір уақытта пайдаланылмайтын болса, тек осы тәжірибеге арналған жолақтар мен реагенттерді шығарып, қалған жолақтар мен реагенттерді қажетті күйде қалдырыңыз.

2. Жуу буфері: 800 мл 1× жуу буферін дайындау үшін 40 мл 20× концентрлі жуу буферін 760 мл деионизацияланған немесе тазартылған сумен сұйылтыңыз.

3. Стандартты: қолданар алдында ерітіндіні қысқаша айналдырыңыз немесе центрифугалаңыз.Берілген төрт стандарттың концентрациясы 5нг/мкл.UTP және pUTP dsRNA стандарттары үшін стандартты қисық сызықты сызу үшін ерітіндіні STE буферімен 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0пг/мкл дейін сұйылтыңыз.N1-Me-pUTP dsRNA стандарттары үшін стандартты қисық сызықты сызу үшін ерітіндіні STE буферімен 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0пг/мкл дейін сұйылтыңыз.5-OMe-UTP dsRNA стандарты үшін стандартты қисық сызықты сызу үшін ерітіндіні STE буферімен 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0пг/мкл дейін сұйылтыңыз.Біз стандарттарды келесі диаграммалар түрінде сұйылтуға болатынын ұсынамыз:

4. Биотинделген анықтау антиденесі және HRP-стрептавидин жұмыс ерітіндісі: қолданар алдында ерітіндіні қысқаша айналдырыңыз немесе центрифугалаңыз.Оларды сұйылту буферімен жұмыс концентрациясына дейін сұйылтыңыз.

5. TMB қосалқы күйі: стерильденген ұштармен ерітіндінің қажетті дозасын сорып алыңыз және қалдық ерітіндіні құтыға қайтадан төгіп алмаңыз.TMB қосалқы күйі жарыққа сезімтал, TMB субстратына ұзақ уақыт бойы жарық түсірмеңіз.

Протоколды қолдану

1. Талдау үшін қажетті жолақтардың санын анықтаңыз.Қолдану үшін жолақтарды жақтауларға салыңыз.Осы талдауда пайдаланылмаған қалған пластина жолақтарын кептіргішпен қапқа қайта салу керек.Тоңазытқышта сақтау үшін сөмкені мықтап жабыңыз.

2. Стандартты, дайындаманың және үлгілердің сұйылтуларының әрқайсысына 100 мкл тиісті ұңғымаларға қосыңыз.Пластинаны тығыздағышпен жабыңыз.Бөлме температурасында 500 айн/мин жылдамдықпен шайқау арқылы 1 сағат инкубациялаңыз.Үлгілерді дәл талдау үшін сәйкес концентрацияға дейін STE буферімен сұйылту керек.

3. Жуу қадамы: ерітіндіні сорып алыңыз және әр ұңғымаға 250 мкл жуу буферімен жуыңыз және оны 30 секундқа қалдырыңыз.Пластинаны сіңіргіш қағазға қысу арқылы жуу буферін толығымен тастаңыз.Барлығы 4 рет жуыңыз.

4. Әрбір ұңғымаға 100 мкл биотинленген анықтау антиденелерінің жұмыс ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны тығыздағышпен жабыңыз.Бөлме температурасында 500 айн/мин жылдамдықпен шайқау арқылы 1 сағат инкубациялаңыз.

5. Жуу қадамын қайталаңыз.

6. Әрбір ұңғымаға 100 мкл HRP-стрептавидин жұмыс ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны тығыздағышпен жабыңыз.Бөлме температурасында 500 айн/мин жылдамдықпен шайқау арқылы 30 минут инкубациялаңыз.

7. Жуу қадамын қайтадан қайталаңыз.

8. Әрбір шұңқырға 100 мкл TMB субстрат ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны тығыздағышпен жабыңыз.RT-де 30 минут инкубациялаңыз Жарықтан қорғаңыз.Субстрат ерітіндісін қосқанда сұйықтық көк түске айналады.

9. Әрбір шұңқырға 50 мкл тоқтату ерітіндісін қосыңыз.Тоқтатқыш ерітінді қосу арқылы сұйықтық сарыға айналады.Содан кейін микропластинаны оқу құралын іске қосып, дереу 450 нм өлшеуді жүргізіңіз.

Нәтижелерді есептеу

1. Әрбір стандарт, бақылау және үлгілер үшін қайталанатын көрсеткіштердің орташа мәнін алыңыз және орташа нөлдік стандартты оптикалық тығыздықты шегеріңіз.Вертикаль(Y) осінде сіңіру қабілеті және көлденең(X）осі бойынша dsRNA концентрациясы бар стандартты қисық сызықты тұрғызыңыз.

2. Есептеуді 5 немесе 4 параметрлі сызықты емес сәйкестік үлгісінде қисық сарапшы 1.3 немесе ELISA Calc сияқты компьютер негізіндегі қисық сызықты орнату бағдарламалық құралымен орындау ұсынылады.

Өнімділік

1. Сезімталдық:

анықтаудың төменгі шегі: ≤ 0,001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA үшін), ≤ 0,01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA үшін).

санның төменгі шегі: 0,0156 пг/мкл (UTP-, pUTP-dsRNA үшін), 0,0312 пг/мкЛ (N1-Me-pUTP-dsRNA үшін), 0,0625 пг/мкЛ (5-OMe-UTP-dsRNA үшін).

2. Дәлдік: талдау ішілік түйіндеме ≤10%, талдау аралық CV ≤10%

3. Қалпына келтіру: 80% ~ 120%

4.Сызықтық:0,0156-0,5пг/мкЛ(UTP-,pUTP-dsRNA үшін)0,0312-1пг/мкЛ(N1-Me-pUTP dsRNA үшін),0,0625-1пг/мкЛ (5-OMe-UTP-dsRNA үшін).

Қарастырулар

1. TMB реакциясының температурасы мен уақыты өте маңызды, оларды нұсқаулыққа сәйкес қатаң түрде бақылаңыз.

2. Талдаудың жақсы қайталануы мен сезімталдығына қол жеткізу үшін реакцияға түспеген артық реагенттерді кетіру үшін пластиналарды дұрыс жуу өте маңызды.

3. Барлық реагенттерді қолданар алдында мұқият араластыру керек және үлгіні немесе реагенттерді қосу кезінде бөртпелердің пайда болуына жол бермеу керек.

4. Концентрлі жуу буферінде (20x) кристалдар пайда болса, 37℃ дейін жылытыңыз және кристалдар толығымен ерігенше ақырын араластырыңыз.

5. Құрамында натрий азиді (NaN3) бар үлгілерді талдаудан аулақ болыңыз, себебі ол HRP белсенділігін бұзып, dsRNA мөлшерінің төмен бағалануына әкелуі мүмкін.

6. Талдау кезінде RNase ластануын болдырмаңыз.

7. Стандартты/үлгі, анықтау антиденелері және SA-HRP RT кезінде шайқаусыз жүргізілуі мүмкін, бірақ бұл анықтау сезімталдығының бір есе төмендеуіне әкелуі мүмкін.Бұл жағдайда UTP және pUTP dsRNA стандарттарын 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA стандарттарын 4pg/μL және 5-OMe-UTP dsRNA стандартын 8pg/μL дейін сұйылтуды ұсынамыз.Сонымен қатар, HRP-стрептавидин жұмыс ерітіндісін бөлме температурасында 60 минут инкубациялаңыз.Колба шайқағышты пайдаланбаңыз, себебі колбаны шайқау дұрыс емес нәтижеге әкелуі мүмкін.

Типтік нәтиже

1. Стандартты қисық деректер

2. Стандартты қисық есептеу

3. Лайнерді анықтау диапазоны: 0,0312- 1пг/мкл