Протеиназа K (лиофилденген ұнтақ)
Мысықтың №: HC4500A
Протеиназа K – кең субстрат ерекшелігі бар тұрақты сериндік протеаза.Ол көптеген ақуыздарды табиғи күйде, тіпті жуғыш заттар болған кезде де ыдыратады.Кристалл және молекулалық құрылымды зерттеуден алынған дәлелдер ферменттің белсенді учаскелік каталитикалық триада (Asp) бар субтилизиндер тұқымдасына жататынын көрсетеді.39-Оның69- Сер224).Бөлінудің басым орны - блокталған альфа-амин қышқылдары бар алифатты және ароматты аминқышқылдарының карбоксил тобына іргелес пептидтік байланыс.Ол әдетте оның кеңдігі үшін қолданыладыерекшелігі.
Сақтау шарттары
2-8 ℃ қысқа мерзімді сақтау, -25 ~ -15 ℃ ұзақ мерзімді сақтау.Құрғақ ұнтақ күйі -25~-15℃ 3 жылға жарамды;фермент ұнтағын тиісті көлемде еріту керек.
Техникалық сипаттама
| Сыртқы түрі | Ақ немесе ақ түсті аморфты лиофилденген ұнтақ |
| Белсенділік | ≥30 U/мг |
| ДНаз | Ешқайсысы анықталмады |
| RNase | Ешқайсысы анықталмады |
Қасиеттер
| EC нөмірі | 3.4.21.64 (Tritirachium альбомының рекомбинанты) |
| Молекулалық салмақ | 29 кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрлік нүкте | 7.81 |
| Оңтайлы рН | 7,0-12,0 1-сурет |
| Оңтайлы температура | 65 ℃ 2-сурет |
| рН тұрақтылығы | рН 4,5-12,5 (25℃, 16 сағ) 3-сурет |
| Термиялық тұрақтылық | 50℃ төмен (рН 8,0, 30 мин) 4-сурет |
| Активаторлар | SDS, мочевина |
| Ингибиторлар | диизопропилфторфосфат;фенилметилсульфонилфториді |
Қолданбалар
1. Генетикалық диагностикалық жинақ
2. РНҚ және ДНҚ экстракциялық жинақтары
3. Ұлпалардан белокты емес компоненттерді алу, ДНҚ вакциналары сияқты ақуызды қоспаларды ыдырату және гепаринді дайындау
4. Импульстік электрофорез арқылы хромосоманың ДНҚ-сын дайындау
5. Вестерн дақ
6. Ферментативті гликозилденген альбуминді реагенттер in vitro диагностикасы
Сақтық шаралары
Қолдану немесе өлшеу кезінде қорғаныс қолғаптары мен көзілдіріктерді киіңіз және қолданғаннан кейін жақсы желдетіңіз.Бұл өнім терінің аллергиялық реакциясын және көздің қатты тітіркенуін тудыруы мүмкін.Деммен жұтса, ол аллергия немесе демікпе белгілерін немесе ентігуді тудыруы мүмкін.Тыныс алу жолдарының тітіркенуін тудыруы мүмкін.
Талдау
Бірлік анықтамасы
Бір бірлік (U) келесі шарттарда минутына 1 мкмоль тирозин алу үшін казеинді гидролиздеуге қажетті ферменттің мөлшері ретінде анықталады.
Реагенттерді дайындау
I реагент: 1 г сүт казеин 50 мл 0,1 М натрий фосфат ерітіндісінде (рН 8,0) ерітілді, 65-70 ℃ суда 15 минут бойы инкубацияланды, араластырылды және ерітілді, сумен салқындатылды, натрий гидроксидімен рН 8,0 деңгейіне дейін реттеледі және бекітілген көлемге келтірілді. 100 мл.
II реагент: 0,1М үшхлорсірке қышқылы, 0,2М натрий ацетаты, 0,3М сірке қышқылы.
III реагент: 0,4M Na2CO3шешім.
IV реагент: Форинт реагенті 5 рет таза сумен сұйылтылған.
V реагент: ферментті еріткіш: 0,1М натрий фосфатының ерітіндісі (рН 8,0).
VI реагент: тирозин ерітіндісі: 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозин 0,2М HCL ерітілген.
Процедура
1. 0,5 мл реагент I 37 ℃ дейін алдын ала қыздырылады, 0,5 мл фермент ерітіндісін қосыңыз, жақсылап араластырыңыз және 37 ℃ температурада 10 минут бойы инкубациялаңыз.
2. Реакцияны тоқтату үшін 1 мл реагент II қосыңыз, жақсылап араластырыңыз және 30 минут бойы инкубацияны жалғастырыңыз.
3. Реакция ерітіндісін центрифугалау.
4. 0,5 мл үстіңгі затты алыңыз, 2,5 мл реагент III, 0,5 мл реагент IV қосыңыз, жақсылап араластырыңыз және 37 ℃ температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз.
5. ОД660ОД деп анықталды1;бос бақылау тобы: 0,5 мл реагент V OD анықтау үшін фермент ерітіндісін ауыстыру үшін қолданылады660OD ретінде2, ΔOD=OD1-ОД2.
6. L-тирозин стандартты қисығы: 0,5 мл әртүрлі концентрациядағы L тирозин ерітіндісі, 2,5 мл III реактив, 5 мл центрифуга түтігіндегі 0,5 мл IV реагент, 30 минут бойы 37℃ инкубациялаңыз, OD үшін анықтаңыз660L-тирозиннің әртүрлі концентрациясы үшін, содан кейін стандартты қисық Y=kX+b алынды, мұндағы Y – L- тирозин концентрациясы, X – OD600.
Есептеу
2: реакция ерітіндісінің жалпы көлемі (мл)
0,5: Фермент ерітіндісінің көлемі (мл)
0,5: хромогенді анықтауда қолданылатын реакция сұйықтығының көлемі (мл)
10: реакция уақыты (мин)
Df: Көп сұйылту
C: Фермент концентрациясы (мг/мл)
Анықтамалар
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Биофиз.Res.Коммун.(1971);44:513.
3. Хилз, Х.т.б.,EUR.J. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Сэмбрук Джet т.б., Молекулалық клондау: зертханалық нұсқаулық, 2-ші басылым, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
2-сурет Оңтайлы температура
20 мМ К-фосфат буферіндегі реакция рН 8,0.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
3-сурет рН Тұрақтылық
25℃, 16 сағ 50мМ буферлік ерітіндімен өңдеу: рН 4,5-5,5, Ацетат;рН 6,0-8,0, Na-фосфат;рН 8,0-9,0, Tris-HCL.рН 9,0-12,5, глицин-NaOH.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
4-сурет Жылулық тұрақтылық
50 мм Tris-HCL буферімен 30 минуттық өңдеу, рН 8,0.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
5-сурет Сақтау тұрақтыty at 25℃
