мРНҚ Кап2'-О-Метилтрансфераза
mRNA Cap 2´ -O-метилтрансфераза вакцина mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase генін тасымалдайтын рекомбинантты E. coli штаммынан алынған.Бұл фермент РНҚ-ның 5-ұшындағы қақпақ құрылымына іргелес бірінші нуклеотидтің 2´-O позициясына метил тобын қосады. Фермент қақпақпен жабылған РНҚ (қақпақ) метилдеу үшін метил доноры ретінде S-аденозилметионинді (SAM) пайдаланады. -0) нәтижесінде қақпақ- 1 құрылымы пайда болады.
Cap1 құрылымы трансфекция және микроинъекция эксперименттерінде мРНҚ экспрессиясын жақсарта отырып, трансляция тиімділігін арттыра алады. Бұл фермент субстрат ретінде m7GpppN қалпақшасы бар РНҚ-ны ерекше қажет етеді.Ол 5´ ұшында pN, ppN, pppN немесе GpppN бар РНҚ-ны пайдалана алмайды.Қақпағы бар РНҚ қақпақ аналогын қолдану арқылы in vitro транскрипциясы арқылы немесе Vaccinia Capping Enzyme арқылы ферментативті жабу арқылы дайындалуы мүмкін.
Құрамдас бөліктер
мРНҚ қақпағы 2´-О-метилтрансфераза (50U/мкл)
10×Жабылатын реакция буфері
Сақтау
Сақтау үшін -25 ～- 15 ℃ （ Қайталанатын мұздату-еріту циклдарын болдырмаңыз）
Сақтау буфері
20 мМ Tris-HCl（pH 8,0，25℃), 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0. 1 мМ EDTA, 0.1% Triton X- 100， 50% глицерин.
Бірлік анықтамасы
Бір бірлік 37°C температурада 1 сағатта 80 нт жабылған РНҚ транскриптінің 10 пмолын метилдеу үшін қажетті ферменттің мөлшері ретінде анықталады.
Сапаны бақылау талдаулары
Экзонуклеаза:50U мРНҚ қақпағы 2´ -О-метилтрансферазасы бар 1мкг λ-Hind III дайджест ДНҚ 37 ℃ температурада 16 сағат бойы агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградация болмайды.
Эндонуклеаза: 50 U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase бар 1 мкг λDNA бар 37℃ температурада 16 сағат бойы агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградация болмайды.
Никаза: 37 ℃ температурада 16 сағат бойы 1 мкг pBR322 бар 50U мРНҚ қақпағы 2´ -О-Метилтрансфераза агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградацияны бермейді.
RNase: 37℃ температурада 4 сағат бойы 1,6 мкг MS2 РНҚ бар 50U мРНҚ қақпағы 2´ -О-Метилтрансфераза агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградацияны тудырмайды.
E. coli ДНҚ: 50U мРНҚ қақпағы 2 ´ -О-метилтрансфераза бар-жоғына тексеріледі.E. coli үшін арнайы праймерлері бар TaqMan qPCR көмегімен геномдық ДНҚE. coli 16S рРНҚ локусы.TheE. coli геномдық ДНҚ ластануы =1E. coli геном.
Бактериялық Эндотоксин: LAL-сынағы, Қытай фармакопеясының IV 2020 басылымына сәйкес, гельді шектеу сынағы әдісі, жалпы ереже (1143).Бактериялық эндотоксин мөлшері =10 ЕС/мг болуы керек.
Реакция жүйесі және шарттары
1. 1,5 мл микрофуга түтігінде 16,0 мкл соңғы көлемге дейін Қақпағы бар РНҚ және RNase жоқ H2O тиісті мөлшерін біріктіріңіз.
2. 65℃ температурада 5 минут қыздырыңыз, содан кейін 5 минут бойы мұз ваннасын алыңыз.
3. Келесі компоненттерді көрсетілген ретпен қосыңыз (Қақпалы РНҚ метилденуі үшін
10-нан аз
| Құрамдас | Көлемі |
| Денатуратталған қақпақпен жабылған РНҚ | 16 мкл |
| 10X жабу реакциясының буфері* | 2 мкл |
| SAM (4 мМ) | 1 мкл |
| мРНҚ қақпағы 2´-О-метилтрансфераза (50 U/мкл) | 1 мкл |
| ddH2O | 20 мкл дейін |
*10× Жабылатын реакция буфері: 500 мМ Tris-HCl(pH 8,0, 25℃), 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2 、 10 мМ DTT.
4. 37℃ температурада 1 сағат бойы инкубациялаңыз (200 нт-тен аз мақсатты фрагмент үшін 2 сағат инкубация ұсынылады).
Қолданбалар
Микроинъекция және трансфекция эксперименттері кезінде мРНҚ экспрессиясын жақсарту.
Қолдану туралы ескертпелер
1. Реакция алдында РНҚ тазартылып, нуклеазасыз суда еріту керек, барлық ерітінділерде ЭДТА және иондар болмауы керек.
2. Транскрипттің 5´ұшындағы қайталама құрылымды жою үшін РНҚ үлгісін реакция алдында 5 минут бойы 65℃ температурада қыздыру ұсынылады.Күрделі 5 ´ терминал құрылымы үшін оны 10 минутқа дейін ұзартуға болады.
