PNGase F
Пептид-N-гликозидаза F(PNGase F) – гликопротеидтерден барлық дерлік N-байланысты олигосахаридтерді жоюдың ең тиімді ферментативті әдісі.PNGase F - N-байланыстырылған гликопротеидтерден жоғары манноза, гибридті және күрделі олигосахаридтердің ең ішкі GlcNAc және аспарагин қалдықтары арасында ыдырайтын амидаза.
Қолдану
Бұл фермент белоктардан көмірсулардың қалдықтарын кетіру үшін пайдалы.
Дайындау және спецификация
| Сыртқы түрі | Түссіз сұйықтық |
| Ақуыздың тазалығы | ≥95% (SDS-PAGE-ден) |
| Белсенділік | ≥500 000 U/мл |
| Экзогликозидаза | Ешқандай әрекет анықталмады (ND) |
| Эндогликозидаза F1 | ND |
| Эндогликозидаза F2 | ND |
| Эндогликозидаза F3 | ND |
| Эндогликозидаза H | ND |
| Протеаза | ND |
Қасиеттер
| EC нөмірі | 3.5.1.52(Микроорганизмнен алынған рекомбинантты) |
| Молекулалық салмақ | 35 кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрлік нүкте | 8. 14 |
| Оңтайлы рН | 7,0-8,0 |
| Оңтайлы температура | 65 °C |
| Субстраттың ерекшелігі | GlcNAc және аспарагин қалдықтары арасындағы гликозидтік байланыстарды ажырату 1-сурет |
| Тану сайттары | Құрамында α1-3 фукоза болмаса, N-байланыстырылған гликандар 2-сурет |
| Активаторлар | DTT |
| Ингибитор | SDS |
| Сақтау температурасы | -25 ~-15 ℃ |
| Жылу инактивациясы | 1 мкл PNGase F бар 20 мкл реакция қоспасы 75 °C температурада 10 минут бойы инкубациялау арқылы белсендірілмейді. |
1-сурет PNGase F субстрат ерекшелігі
2-сурет PNGase F тану орындары.
Ішкі GlcNAc қалдықтары α1-3 фукозамен байланысқанда, PNGase F N-байланыстырылған олигосахаридтерді гликопротеидтерден ажырата алмайды.Бұл модификация өсімдіктерде және кейбір жәндіктердің гликопротеиндерінде жиі кездеседі.
Cқарсыластар
|
| Құрамдас бөліктер | Шоғырлану |
| 1 | PNGase F | 50 мкл |
| 2 | 10×Гликопротеинді денатуризациялаушы буфер | 1000 мкл |
| 3 | 10 × Гликобуфер 2 | 1000 мкл |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 мкл |
Бірлік анықтамасы
Бір бірлік(U) жалпы реакция көлемі 10 мкл болатын 37°C температурада 10 мкг денатуратталған RNase B-ден көмірсулардың >95%-ын алып тастау үшін қажетті ферменттің мөлшері ретінде анықталады.
Реакция шарттары
1. 1-20 мкг гликопротеинді ионсыздандырылған сумен ерітіңіз, 10 мкл жалпы реакция көлемін алу үшін 1 мкл 10 × гликопротеинді денатуризациялау буферін және H2O (қажет болса) қосыңыз.
2.100°C температурада 10 минут инкубациялаңыз, мұзда суытыңыз.
3.2 мкл 10×GlycoBuffer 2, 2 мкл 10% NP-40 қосып, араластырыңыз.
4.1-2 мкл PNGase F және H қосыңыз2О (қажет болса) 20 мкл жалпы реакция көлемін алу және араластыру.
5.Реакцияны 37°C температурада 60 минут бойы инкубациялаңыз.
6.SDS-PAGE талдауы немесе HPLC талдауы үшін.
