Vaccinia вирусын жабу ферменті

Vaccinia вирусын жабу ферменті Vaccinia жабу ферментінің гендерін тасымалдайтын рекомбинантты E. coli штаммынан алынған.Бұл жалғыз фермент екі суббірліктен (D1 және D12) тұрады және үш ферментативті белсенділікке ие (D1 суббірлігі бойынша РНҚ трифосфатаза және гуанилиттрансфераза және D12 суббірлігі бойынша гуанинметилтрансфераза).Vaccinia вирусын жабу ферменті 7-метилгуанилат қақпақ құрылымын (m7Gppp, Cap 0) РНҚ-ның 5′ ұшына арнайы бекіте алатын қақпақ құрылымының түзілуін катализдеу үшін тиімді.Қақпақ құрылымы (Cap 0) эукариоттарда мРНҚ тұрақтануында, тасымалдануында және трансляциясында маңызды рөл атқарады.РНҚ-ны ферментативті реакция арқылы жабу - in vitro транскрипция, трансфекция және микроинъекция үшін РНҚ тұрақтылығы мен трансляциясын айтарлықтай жақсартатын тиімді және қарапайым әдіс.

Құрамдас бөліктер

Vaccinia вирусын жабу ферменті (10 U/мкл)

10×Тұйықтау буфері

Сақтау шарттары

Сақтау үшін -25～- 15℃ （ Қайталанатын мұздату-еріту циклдарынан аулақ болыңыз）

Сақтау буфері

20 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 100 мМ NaCl,

1мМ DTT, 0. 1мМ ЭДТА, 0.1% Triton X- 100, 50% глицерин.

Бірлік анықтамасы

Vaccinia вирусын жабу ферментінің бір бірлігі 37°C температурада 1 сағатта 80nt транскриптіне 10пмоль GTP қосу үшін қажетті фермент мөлшері ретінде анықталады.

Сапа бақылауы

Экзонуклеаза:37 ℃ температурада 16 сағат бойы 1 мкг λ-Hind III дайджест ДНҚ-сы бар 10U Vaccinia вирусын жабу ферменті агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградацияны тудырмайды.

Эндонуклеаза:16 сағат бойы 37℃ температурада 1 мкг λДНҚ бар 10U Vaccinia вирусын жабу ферменті агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградацияны тудырмайды.

Никаза:16 сағат бойы 37 ℃ температурада 1 мкг pBR322 бар 10U Vaccinia вирусын жабу ферменті агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградацияны тудырмайды.

RNase:1,6 мкг MS2 РНҚ бар 10U Vaccinia вирусын жабу ферменті 37℃ температурада 4 сағат бойы агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградацияны тудырмайды.

1.coli ДНҚ:10U Vaccinia вирусын жабу ферменті E. coli 16S rRNA локусына тән праймерлері бар TaqMan qPCR көмегімен E. coli геномдық ДНҚ бар-жоғына тексеріледі.E. coli геномдық ДНҚ ластануы ≤1 E. coli геномы болып табылады.

2.Бактериялық Эндотоксин: LAL-сынағы, Қытай фармакопеясының IV 2020 басылымына сәйкес, гельді шектеу сынағы әдісі, жалпы ереже (1143).Бактериялық эндотоксин мөлшері ≤10 EU/mg болуы керек.

Реакция жүйесі және шарттары

1. Қаптау хаттамасы (реакция көлемі: 20 мкл)

Бұл процедура 10 мкг РНҚ (≥100 nt) жабу реакциясына қолданылады және оны эксперименттік талаптарға сәйкес ұлғайтуға болады.

I) 10 мкг РНҚ және нуклеазасыз H2O 1,5 мл микрофуга түтігінде 15,0 мкл соңғы көлемге дейін біріктіріңіз.*10×Тұйықтау буфері: 0,5М Tris-HCl, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, (25℃, рН 8,0)

2) 65℃ температурада 5 минут қыздырыңыз, содан кейін 5 минут мұз ваннасын қосыңыз.

3) Келесі компоненттерді көрсетілген ретпен қосыңыз

*10×Тұйықтау буфері: 0,5 М Tris-HCl, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, (25℃, pH8,0)

4) 37°C температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз, РНҚ енді жабылған және төменгі ағындағы қолданбаларға дайын.

2. 5′ терминал таңбалау реакциясы (реакция көлемі: 20 мкл)

Бұл хаттама құрамында 5´ трифосфаты бар РНҚ-ны таңбалауға арналған және оны сұраныстарға сәйкес ұлғайтуға болады.Жапсырманы енгізу тиімділігіне РНҚ: GTP молярлық қатынасы, сондай-ақ РНҚ үлгілеріндегі GTP мазмұны әсер етеді.

1) 1,5 мл микрофуга түтігінде РНҚ және нуклеазасыз H2O тиісті мөлшерін 14,0 мкл соңғы көлемге дейін біріктіріңіз.

2) 65℃ температурада 5 минут қыздырыңыз, содан кейін 5 минут мұз ваннасын қосыңыз.

3) Келесі компоненттерді көрсетілген ретпен қосыңыз.

** GTP MIX GTP және маркерлердің аз санына қатысты.GTP концентрациясын қараңыз3 ескертпеге.

4) 37°C температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз, РНҚ 5′ ұшы енді таңбаланған және төменгі ағынға дайын.

Қолданбалар

1. Трансляция талдаулары/in vitro аудармасы алдында мРНҚ-ны жабу

2. mRNA-ның 5´ ұшын таңбалау

Қолдану туралы ескертпелер

1.РНҚ ерітіндісін Vaccinia Capping Enzyme көмегімен инкубациялау алдында қыздыру транскрипттің 5-ұшындағы қайталама құрылымды жояды.Белгілі жоғары құрылымды 5´ұштары бар транскрипттер үшін уақытты 60 минутқа дейін ұзартыңыз.

2. Реакцияларды жабу үшін пайдаланылатын РНҚ қолданар алдында тазартылып, нуклеазасыз суда суспензиялануы керек.ЭДТА болмауы керек және ерітіндіде тұздар болмауы керек.

3. 5´ ұшын таңбалау үшін жалпы GTP концентрациясы реакциядағы мРНҚ молярлық концентрациясынан 1-3 есе көп болуы керек.

4. Реакция жүйесінің көлемін нақтыға сәйкес жоғарылатуға немесе азайтуға болады.