5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Мысықтың №: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) – бір сатылы кері транскрипцияға және сандық ПТР (qRT-PCR) үшін жарамды, тұрақты бір түтікке негізделген зонд негізіндегі қоспасы.Ол праймерлер мен зондтарды алдын ала араластыруды қолдайды және төмен температурада ұзақ уақыт сақтаудан кейін тұрақты болып қалады.Сыналатын үлгіні пайдалану кезінде қосымша түтікті ашу/тамшуырлау операциясынсыз тікелей қосуға болады.Бұл өнім компоненттермен қамтамасыз етеді, мысалы, ыстық басталатын ДНҚ полимераза, M-MLV, ыстыққа төзімді урацил ДНҚ гликозилаза (TS-UNG), RNase тежегіші, MgCl2, dNTP (dTTP орнына dUTP бар) және тұрақтандырғыштар.Генетикалық түрлендірілген жылдам күшейту кері транскриптаза және ДНҚ полимераза көмегімен ПТР күшейтуді 20-40 минут ішінде аяқтауға болады.Бұл реагент тежегішке қарсы күшейту ферменті мен UNG ферментінің аралас ферменттері бар qPCR үшін арнайы буферді пайдаланады.Сондықтан ол мақсатты гендердің жақсы күшейтілуін ала алады және ПТР қалдығы мен аэрозольді ластанудан туындаған жалған күшейтуді болдырмайды.Бұл реагент Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad және Roche сияқты өндірушілердің көптеген флуоресцентті сандық ПТР құралдарымен үйлесімді.
Құрамдас
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix буфері (dUTP)
Сақтау шарттары
Барлық компоненттер ұзақ мерзімді сақтау үшін -20 ° C температурада және 3 айға дейін 4 ° C температурада сақталуы керек.Ерігеннен кейін мұқият араластырыңыз және қолданар алдында центрифугалаңыз.Жиі мұздату-ерітуден аулақ болыңыз.
qRT-ПТР реакция жүйесін дайындау
| Құрамдас бөліктер | 25мклЖүйе | 50мклЖүйе | Қорытынды концентрация |
| 5×Neoscript Fast RT Premix буфері (dUTP) | 5 мкл | 10 мкл | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| 25×Праймер-зонд қоспасыa | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Үлгі РНҚb | – | – | – |
| ddH2O | 25 мкл дейін | 50 мкл дейін | – |
1) а. Праймердің соңғы концентрациясы әдетте 0,2 мкм құрайды.Жақсырақ нәтиже алу үшін праймер концентрациясын 0,2-1μM диапазонында оңтайландыруға болады.Жалпы, зонд концентрациясын 0,1-0,3μM диапазонында оңтайландыруға болады.
2) b. Жылдам ПТР процедурасын пайдаланған кезде, праймерлер мен зондтардың концентрациясын арттыру күшейту нәтижелерінің жақсырақ болуына әкелуі мүмкін және олардың арақатынасы тиісінше оңтайландырылған болуы керек.
3) Сынамалардың әртүрлі түрлері ингибитордың әртүрлі түрлері мен мазмұнын және мақсатты геннің көшірме санын қамтиды.Үлгі көлемін нақты жағдай бойынша қарастыру керек.Қажет болса, үлгіні нуклеазасыз сумен немесе TE буферімен сұйылтыңыз.
Реакция Cшарттар
| Тұрақты ПТР процедурасы | Жылдам ПТР процедурасы | ||||||
| Процедура | Темп. | Уақыт | Цикл | Процедура | Темп. | Уақыт | Цикл |
| Кері транскрипция | 50℃ | 10-20 мин | 1 | Кері транскрипция | 50℃ | 5мин | 1 |
| Полимераз Белсендіру | 95℃ | 1-5 мин | 1 | Полимераз Белсендіру | 95℃ | 30с | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 10-20 с | 40-50 | Денатурация | 95℃ | 1-3с | 40-50 |
| Күйдіру және Кеңейтім | 56-64℃ | 20-60 жж | Күйдіру және Кеңейтім | 56-64℃ | 3-20 с | ||
Сапа бақылауы
1.Функцияны анықтау: qPCR сезімталдығы, ерекшелігі және қайталануы.
2.Экзогендік нуклеаза белсенділігі жоқ: экзогендік эндонуклеаза және экзонуклеаза ластануы жоқ.
Ескертпелер
1.Жылдам ДНҚ-полимеразаның күшейту жылдамдығы 1кб/10с кем емес.Әртүрлі ПТР құралдарының әртүрлі қыздыру және салқындату жылдамдықтары, температураны бақылау режимдері және жылу өткізгіштігі бар, сондықтан праймер/зонд концентрациясын және арнайы жылдам ПТР құралымен бірге жұмыс істеу әдісін оңтайландыру өте маңызды.
2.Бұл өнім кең қолдану мүмкіндігін береді және ол жоғары сезімталдықтағы молекулалық диагностикаға жарамды.Үш сатылы ПТР әдісі жасыту температурасы төмен праймерлер үшін немесе 200 бит жоғары ұзын фрагменттерді күшейту үшін ұсынылады.
3.Әр түрлі ампликондардың dUTP пайдалану тиімділігі және UNG-ге әртүрлі сезімталдығы болғандықтан, UNG жүйесін пайдалану кезінде анықтау сезімталдығы төмендесе, реагенттерді оңтайландыру керек.Қажет болса, техникалық қолдау алу үшін бізге хабарласыңыз.
4.Тасымалданатын ПТР өнімдерін күшейтуді болдырмау үшін күшейту үшін арнайы тәжірибе алаңы және тамшуыр қажет.Қолғаппен операция жасаңыз және жиі ауыстырыңыз және күшейтілгеннен кейін ПТР түтігін ашпаңыз.
