Протеиназа K NGS (ұнтақ)
Мысықтың №: HC4507A
NGS Protease K – жоғары ферменттік белсенділігі және кең субстрат спецификасы бар тұрақты сериндік протеаза. Фермент гидрофобты аминқышқылдарының, күкірті бар аминқышқылдарының және хош иісті аминқышқылдарының С-терминалына жақын эфирлік байланыстар мен пептидтік байланыстарды ыдыратады.Сонымен, ол ақуыздарды қысқа пептидтерге ыдырату үшін жиі қолданылады.NGS Protease K - Asp бар типтік сериндік протеаза39-Оның69- Сер224Сериндік протеазаларға ғана тән каталитикалық триада және каталитикалық орталық Ca сүйірмесімен қоршалған.2+жағдайлардың кең диапазонында жоғары ферменттік белсенділікті сақтай отырып, тұрақтандыруға арналған байланыстыру орындары.
Техникалық сипаттама
| Сыртқы түрі | Ақтан ақ дерлік түске дейінгі аморфты ұнтақ, лиофилденген |
| Арнайы әрекет | ≥40U/мг қатты |
| ДНаз | Ешқайсысы анықталмады |
| RNase | Ешқайсысы анықталмады |
| Биологиялық жүктеме | ≤50CFU/г қатты |
| Нуклеин қышқылының қалдығы | <5пг/мг қатты |
Қасиеттер
| Дереккөз | Tritirachium альбомы |
| EC нөмірі | 3.4.21.64(Tritirachium альбомындағы рекомбинантты) |
| Молекулалық салмақ | 29кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрлік нүкте | 7.81 1-сурет |
| Оңтайлы рН | 7,0-12,0 (Барлығы жоғары белсенділік көрсетеді) 2-сурет |
| Оңтайлы температура | 65℃ 3-сурет |
| рН тұрақтылығы | рН 4,5-12,5 (25℃,16 сағ) 4-сурет |
| Термиялық тұрақтылық | 50℃ төмен (рН 8,0, 30 мин) 5-сурет |
| Сақтау тұрақтылығы | 25℃ температурада 12 ай сақталады 6-сурет |
| Активаторлар | SDS, мочевина |
| Ингибиторлар | диизопропилфторфосфат;бензилсульфонилфториді |
Сақтау шарттары
Лиофилизацияланған ұнтақты -25~-15 ℃ температурада жарықтан алыс ұзақ уақыт сақтаңыз;Ерігеннен кейін, жарықтан алыс жерде 2-8 ℃ қысқа мерзімді сақтау үшін немесе жарықтан алыс -25 ~ -15 ℃ ұзақ мерзімді сақтау үшін тиісті көлемге аликвотты алыңыз.
Сақтық шаралары
Қолдану немесе өлшеу кезінде қорғаныс қолғаптары мен көзілдіріктерді киіңіз және қолданғаннан кейін жақсы желдетіңіз.Бұл өнім терінің аллергиялық реакциясын және көздің қатты тітіркенуін тудыруы мүмкін.Деммен жұтса, ол аллергия немесе демікпе белгілерін немесе ентігуді тудыруы мүмкін.Тыныс алу жолдарының тітіркенуін тудыруы мүмкін.
Бірлік анықтамасы
NGS Protease K бір бірлігі стандартты анықтау жағдайында казеинді 1 мкмоль L-тирозинге гидролиздеу үшін қажетті фермент мөлшері ретінде анықталады.
Реагенттерді дайындау
| Реагент | Өндіруші | Каталог |
| Казеин техникалықсиыр сүтінен | Сигма Олдрих | C7078 |
| NaOH | Sinopharm химиялықReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Sinopharm химиялықReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm химиялықReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Трихлорсірке қышқылы | Sinopharm химиялықReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Натрий ацетаты | Sinopharm химиялықReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Сірке қышқылы | Sinopharm химиялықReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm химиялықReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Натрий карбонаты | Sinopharm химиялықReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Фолин-фенол | Sangon Biotech (Шанхай)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-тирозин | Сигма | 93829 |
I реагент:
Субстрат: сиыр сүтінің ерітіндісінен алынған 1% казеин: 1 г сиыр сүтінің казеинін 50 мл 0,1 М натрий фосфат ерітіндісінде ерітіңіз, рН 8,0, су моншасында 65-70 °C температурада 15 минут қыздырыңыз, араластырыңыз және ерітіңіз, сумен салқындатыңыз, реттеледі. натрий гидроксидін рН 8,0 дейін және 100 мл дейін сұйылтыңыз.
II реагент:
TCA ерітіндісі: 0,1М трихлорсірке қышқылы, 0,2М натрий ацетаты және 0,3М сірке қышқылы (салмағы 1,64 г үшхлорсірке қышқылы + 1,64 г натрий ацетаты + 1,724 мл сірке қышқылының салмағы, дәйекті түрде 50 мл ионсыздандырылған суды қосып, рН3, 0,4 сұйылтылған күйге келтіріңіз. 100 мл).
III реактив:
0,4 м натрий карбонаты ерітіндісі (салмағы 4,24 г сусыз натрий карбонаты және 100 мл суда ерітіңіз)
IV реагент:
Фолин фенол реактиві: ионсыздандырылған сумен 5 рет сұйылтыңыз.
V реагент:
Фермент еріткіші: 0,1 М натрий фосфатының ерітіндісі, рН 8,0.
VI реагент:
L-тирозин стандартты ерітіндісі:0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл L-тирозин 0,2М HCl ерітілген.
Процедура
1. UV-Vis спектрофотометрін қосыңыз және фотометриялық өлшемді таңдаңыз.
2. Толқын ұзындығын 660 нм етіп орнатыңыз.
3. Су моншасын қосыңыз, температураны 37℃ орнатыңыз, температураның 3-5 минут бойы өзгермейтінін қамтамасыз етіңіз.
4. 0,5 мл субстратты 2 мл центрифуга түтігінде 37℃ су моншасында 10 минут бойы алдын ала қыздырыңыз.
5. Алдын ала қыздырылған центрифуга түтігіне 10 минут бойы 0,5 мл сұйылтылған фермент ерітіндісін шығарыңыз.Фермент еріткішін бос топ ретінде орнатыңыз.
6. Реакциядан кейін бірден 1,0 мл TCA реагентін қосыңыз.Жақсылап араластырыңыз және су ваннасында 30 минут инкубациялаңыз.
7. Реакция ерітіндісін центрифугалау.
8. Келесі құрамдастарды көрсетілген ретпен қосыңыз.
| Реагент | Көлемі |
| Супернатант | 0,5 мл |
| 0,4 М натрий карбонаты | 2,5 мл |
| Фолин фенол реактиві | 0,5 мл |
9. Су моншасында 37℃ температурада 30 минут инкубациялау алдында жақсылап араластырыңыз.
10. ОД660ОД деп анықталды1;бос бақылау тобы: ОД анықтау үшін фермент ерітіндісін ауыстыру үшін ферментті еріткіш қолданылады660OD ретінде2, ΔOD=OD1-ОД2.
11. L-тирозин стандартты қисығы: 0,5 мл әртүрлі концентрациядағы L-тирозин ерітіндісі, 2,5 мл 0,4 М натрий карбонаты, 5 мл центрифуга түтігінде 0,5 мл фолин фенол реагенті, 37 ℃ температурада 30 минут инкубациялаңыз, OD үшін анықтаңыз660L-тирозиннің әртүрлі концентрациясы үшін, содан кейін стандартты қисық Y=kX+b алынды, мұндағы Y – L-тирозин концентрациясы, X – OD600.
Есептеу
2: реакция ерітіндісінің жалпы көлемі (мл)
0,5: Фермент ерітіндісінің көлемі (мл)
0,5: хромогенді анықтауда қолданылатын реакция сұйықтығының көлемі (мл)
10: реакция уақыты (мин)
Df: Көп сұйылту
C: Фермент концентрациясы (мг/мл)
Фигуралар
1-сурет ДНҚ қалдығы
| Үлгі | Авен C4 | Нуклеин қышқылы Қалпына келтіру (пг/мг) | Қалпына келтіру(%) | Жалпы нуклеиндік Қышқыл ( пг/мг) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| РНҚсыз H2O | Анықталмаған | — | — | — |
2-сурет Оңтайлы рН
3-сурет Оңтайлы температура
4-сурет рН тұрақтылығы
5-сурет Термиялық тұрақтылық
6-сурет 25℃ температурада сақтау орнықтылығы
