RTL кері транскриптаза
RTL кері транскриптазасы 3'→5' экзонуклеаза белсенділігі жоқ және RNase H белсенділігіне ие РНҚ үлгісіне тәуелді ДНҚ полимераза болып табылады.Бұл фермент РНҚ-ны ДНҚ-ның комплементарлы тізбегін синтездеу үшін шаблон ретінде пайдалана алады, оны бірінші тізбекті кДНҚ синтезіне, әсіресе RT-LAMP (цикл арқылы изотермиялық күшейту) үшін қолдануға болады.RTL кері транскриптаза 1.0 салыстырғанда сезімталдық айтарлықтай жақсарды, термиялық тұрақтылық күшті, ал 65 ° C реакциясы тұрақты.RTL кері транскриптазасы (глицеринсіз) лиофилденген препараттарды, лиофилденген RT-LAMP реагенттерін және т.б. дайындау үшін пайдаланылуы мүмкін.
Бірлік анықтамасы
Бір бірлік поли(A)•oligo(dT)25 үлгісін праймер ретінде пайдаланып, 50°C температурада 20 минут ішінде қышқылмен тұнбаға түсетін материалға 1 нмоль dTTP қосады.
Құрамдас бөліктер
| Құрамдас | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL кері транскриптаза (глицеринсіз) (15U/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 10 мл |
| 10×HC RTL буфері | 1,5 мл | 4×1,5 мл | 5×10 мл |
| MgSO4 (100мМ) | 1,5 мл | 2×1,5 мл | 3×10 мл |
Сақтау жағдайы
0°C төмен температурада тасымалдау және -25°C~-15°C температурада сақтау керек.
Сапа бақылауы
- Қалдық белсенділігіEдонуклеаза:1 мкг λДНҚ және 15 бірлік RTL2.0 37 ℃ температурада 16 сағат инкубацияланған 50 мкл реакция гель электрофорезі арқылы теріс бақылау сияқты үлгіні көрсетеді.
- Қалдық белсенділігіЭкзонуклеаза:1 мкг Hind Ⅲ қорытылған λДНҚ және 15 бірлік RTL2.0 37 ℃ температурада 16 сағат инкубацияланған 50 мкл реакция гель электрофорезі арқылы теріс бақылау сияқты үлгіні көрсетеді.
- Қалдық белсенділігіНиказа:37°C температурада 4 сағат бойы инкубацияланған 1 мкг аса ширатылған pBR322 және 15 бірлік RTL2.0 бар 50 мкл реакция гель электрофорезі арқылы теріс бақылаумен бірдей үлгіні көрсетеді.
- Қалдық белсенділігіRNase:37°C температурада 4 сағат инкубацияланған 0,48 мкг MS2 РНҚ және 15 бірлік RTL2.0 бар 10 мкл реакция гель электрофорезі арқылы теріс бақылау сияқты үлгіні көрсетеді.
- E. coli gДНҚ:көмегімен өлшенедіE.coliарнайы HCD анықтау жинақтары， 15 RTL2.0 бірлігі 1-ден азды қамтидыE. coliгеном.
Реакцияны орнату
cDNA синтезінің хаттамасы
| Құрамдас бөліктер | Көлемі |
| Үлгі РНҚ a | міндетті емес |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) немесе Random Primer қоспасы(60uM) | 2 мкл |
| dNTP қоспасы (әрқайсысы 10 мМ) | 1 мкл |
| RNase ингибиторы (40U/uL) | 0,5 мкл |
| RTL кері транскриптаза 2.0 (15U/uL) | 0,5 мкл |
| 10×HC RTL буфері | 2 мкл |
| Нуклеазсыз су | 20 мкл дейін |
Ескертулер:
1) Жалпы РНҚ ұсынылатын дозасы 1нг~1мкг құрайды
2) мРНҚ ұсынылатын дозасы 50нг~100нг болды
Термо-велосипедпен жүру Күн тәртібіндегі жағдайлар реакция:
| Температура (°C) | Уақыт |
| 25 °Ca | 5мин |
| 55 °C | 10минb |
| 80 °C | 10мин |
Ескертулер:
1) Кездейсоқ праймер қоспасы пайдаланылса, 25°C температурада инкубациялау қадамы.
2) Егер мақсатты праймер қоспасы пайдаланылса, 55°C температурада 10~30 минут инкубациялау қадамы.
RT-LAMP протоколы
| Құрамдас бөліктер | Көлемі | Қорытынды концентрация |
| Үлгі РНҚ | міндетті емес | ≥10 көшірме |
| dNTP қоспасы (10 мМ) | 3,5 мкл | 1,4 мм |
| FIP/BIP праймерлері (25×) | 1 мкл | 1,6 мкм |
| F3/B3 праймерлері (25×) | 1 мкл | 0,2 мкм |
| LoopF/LoopB праймерлері (25×) | 1 мкл | 0,4 мкм |
| RNase ингибиторы (40U/мкл) | 0,5 мкл | 20 U/реакция |
| RTL кері транскриптаза 2.0 (15U/мкл) | 0,5 мкл | 7,5 U/реакция |
| Bst V2 ДНҚ полимераза (8U/мкл) | 1 мкл | 8 U/реакция |
| MgSO4 (100мМ) | 1,5 мкл | 6 мм (барлығы 8 мМ) |
| 10×HC RTL буфері (немесе 10×HC Bst V2 буфері) | 2,5 мкл | 1 × (2мМ Mg2+) |
| Нуклеазсыз су | 25 мкл дейін | - |
Ескертулер:
1) Шайнау арқылы араластырыңыз және жинау үшін қысқа уақытқа центрифугалаңыз.65°C температурада 1 сағат бойы тұрақты инкубациялау.
2) Екі буфер өзара әрекеттеседі және құрамы бірдей.
Ескертпелер
1. Бұл өнім -20 °C температурада сақталған кезде ақ түсті қатты зат түзеді.Оны -20°C-тан алыңыз да, мұзға 10 минуттай қойыңыз.Ерігеннен кейін оны шайқау және араластыру арқылы пайдалануға болады.
2. cDNA өнімін -20°C немесе -80°C температурада сақтауға немесе ПТР реакциясы үшін дереу пайдалануға болады.
3. RNase ластануын болдырмау үшін тәжірибе аймағын таза ұстаңыз және жұмыс кезінде таза қолғап пен бетперде киіңіз.
