ДНҚ экстракциясының шағын жинағы
Бұл жинақ оңтайландырылған буферлік жүйені және TAE немесе TBE агароз гелінің әртүрлі концентрацияларынан 70 bp – 20 кб ДНҚ фрагменттерін қалпына келтіре алатын силикагель бағанасын тазарту технологиясын қолданады.ДНҚ адсорбциялық бағаны жоғары тұз жағдайында ДНҚ-ны арнайы адсорбциялай алады.Сонымен қатар, жинақ ДНҚ фрагменттерін ПТР өнімдерінен, ферментативті реакция жүйелерінен немесе басқа әдістермен алынған шикі ДНҚ өнімдерінен тікелей тазартып, ақуыздар, басқа органикалық қосылыстар, бейорганикалық тұз иондары және олигонуклеотидті праймерлер сияқты қоспаларды жоя алады.Бұл тазалаудың 10-15 минут ішінде аяқталуын қамтамасыз етеді.Тазартылған ДНҚ тікелей байлау, трансформация, ферменттерді қорыту, in vitro транскрипция, ПТР, секвенирлеу, микроинъекция және т.б. үшін пайдаланылуы мүмкін.
Сақтау шарттары
-15 ~ -25 ℃ температурада сақтаңыз және бөлме температурасында тасымалдаңыз.
Құрамдас бөліктер
| Құрамдас бөліктер | (100 rxns) |
| Буферлік ЖІӨ | 80 мл |
| Буфер GW | 2 × 20 мл |
| Элюционды буфер | 20 мл |
| FastPure ДНҚ шағын бағандары-G | 100 |
Буферлік ЖІӨ:ДНҚ байланыстыратын буфер.
Буфер GW:Жуу буфері;қолданар алдында бөтелкеде көрсетілген көлемде абсолютті этанол қосыңыз.
Элюция буфері:Элюция.
FastPure ДНҚ шағын бағандары-G:ДНҚ адсорбция бағандары.
Коллекция түтіктері 2 мл:Фильтратқа арналған түтіктер.
Дайын материалдар
1,5 мл зарарсыздандырылған түтіктер, абсолютті этанол және изопропанол (ДНҚ фрагменті ≤ 100 bp болғанда, 1 көлем қосыңыз.
изопропанолды 1 көлемді гельге дейін), су ваннасы.
Эксперимент процесі
Қолданар алдында затбелгіде көрсетілгендей буфер GW сұйылту үшін 80 мл этанол қосыңыз, бөлме температурасында сақтаңыз.
Механизм
1. ПТР реакциясының ерітіндісі
Гельді экстракциялау схемасы: Бірдей көлемде буферді қосу GDP ПТР реакциясы ерітіндісін қалпына келтіру схемасы:Дыбыс буферін 5 есе арттырыңыз
2. ЖІӨ Гель көлемін есептеңіз(100 μl 100 мг-ға тең)
Гельді ерітіңіз
3. 50 ~ 55 дейін алдын ала қыздырыңыз℃
4. Байланысты жуу
300 мкл буфер ЖІӨ қосыңыз*
700 мкл буфер ГВт қосыңыз
700 мкл буфер ГВт қосыңыз
5. Элюта
20 – 30 мкл Элюционды буфер немесе ионсыздандырылған су қосыңыз
Ескертпелер* ПТР реакциясы сұйықтықты осы қадамсыз қалпына келтіру
Гельді экстракциялау бағдарламасы
1. ДНҚ фрагменттерін фракциялау үшін ДНҚ электрофорезінен кейін УК сәулесінің астында агарозды гельден ДНҚ фрагментінің жалғыз жолағын акциздеңіз.Гельдің көрінетін ылғалдылығын сіңіру және мүмкіндігінше қосымша агарозаны алып тастау арқылы гель тілігінің өлшемін азайту үшін сіңіргіш қағазды пайдалану ұсынылады.Гель тілімін (микроцентрифуга түтігісіз) оның көлемін есептеу үшін өлшеңіз: 100 мг гель тілігінің көлемі тығыздығы 1 г/мл деп есептегенде, шамамен 100 мкл болады.
2. Бірдей көлемдегі буфер GDP қосыңыз, 50~55℃ температурада 7-10 минут бойы инкубациялаңыз (гель өлшеміне сәйкес гель толығымен ерігенше инкубация уақытын реттеңіз).Инкубация кезінде түтікшені 2 рет төңкеріңіз.
Δ Буферлік ЖІӨ 1-3 көлемін қосу ДНҚ қалпына келтіру тиімділігіне әсер етпейді.Егер қалпына келтірілетін ДНҚ фрагменті <100 bp болса, буфер ЖІӨ-нің 3 томын қосу қажет;гель тілігі толығымен еріген кезде, 1 көлем изопропанолды қосып, мұқият араластырыңыз, содан кейін келесі қадамға өтіңіз.
3. Үлгіні түтік түбіне жеткізу үшін қысқаша центрифугалаңыз, FastPure DNA Mini Columns-G 2 мл жинау түтіктеріне салыңыз, ерітіндіні абайлап күніне бір рет максимум 700 мкл ауыстырыңыз.
сүзу колонналарына дейін 12 000 айн/мин (13 800 X г) 30-60 сек центрифугалау.
4. Фильтратты тастаңыз және колоннаға 300 мкл буфер GDP қосыңыз, бөлме температурасында 1 мин инкубациялаңыз, 12 000 айн/мин (13 800 X г) 30-60 сек центрифугалаңыз.
5. Фильтратты тастаңыз және бағанға 700 мкл Buffer GW қосыңыз (абсолюттік этанолдың қосылғанын алдын ала тексеріңіз!), 12 000 айн/мин (13 800 X г) 30-60 сек центрифугалаңыз.
Δ Түтік қабырғасына жабысқан тұзды толығымен жууға көмектесу үшін адсорбциялық бағанның қабырғасының айналасына буфер GW қосыңыз немесе буфердің GW артқы қақпағын қосыңыз және оны төңкеріп 2 – 3 рет араластырыңыз.
6. 5-қадамды қайталаңыз.
Δ GW буферімен екі рет шаю тұздың толығымен жойылуын қамтамасыз етеді және кейінгі тәжірибелердегі әсерді жояды.
7. Фильтратты тастаңыз және бос колонканы 12 000 айн/мин (13 800 X г) 2 мин центрифугалаңыз.
8. Колонканы таза 1,5 мл микроцентрифуга түтігіне салыңыз, колонна мембранасының ортасына 20 - 30 мкл Элюция буферін қосыңыз, 2 минут инкубациялаңыз, содан кейін 12 000 айн/мин (13 800 X г) 1 мин центрифугалаңыз.Колонканы тастаңыз, алынған ДНҚ-ны -20 .
Δ 8-қадамның үстіңгі затын қайтадан элюциялау үшін бағанға тасымалдау және Элюция буферін 55-ке дейін алдын ала қыздыру (ДНҚ фрагменті >3 кб болғанда) қалпына келтіру тиімділігін арттыруға пайдалы болуы мүмкін.
ПТР өнімдерін қалпына келтіру бағдарламасы
Бұл хаттама ДНҚ фрагменттерін ПТР өнімдерінен, ферментативті реакция жүйесінен және басқа ДНҚ шикі өнімдерінен (соның ішінде генетикалық ДНҚ) тазарту үшін қолданылады.Бұл ерітінді әртүрлі нуклеотидтерді, праймерлерді, праймер димерлерін, тұз молекулаларын, ферменттерді және басқа қоспаларды тиімді түрде жоя алады.
1. ПТР өнімдерін, ферментативті реакция ерітіндісін және басқа ДНҚ шикі өнімдерін қысқаша центрифугалаңыз.Тамшуырмен олардың көлемін бағалаңыз және стерильденген 1,5 мл немесе 2 мл түтікке ауыстырыңыз.Көлемі 100 мкл дейін жеткенше ddH2O қосыңыз;ал жоғары концентрациясы бар геномдық ДНҚ үшін ddH2O 300 мкл дейін сұйылту қалпына келтіру тиімділігін арттыруға көмектеседі.
2. Буферлік ЖІӨ-нің 5 көлемін қосыңыз, инверттеу немесе құйып алу арқылы мұқият араластырыңыз.Егер қызығушылық тудыратын ДНҚ фрагменті >100 bp болса, этанолдың қосымша 1,5 көлемін (үлгілер + буферлік GDP) қосу қажет.
3. Колонканы қайтадан жинау түтігіне салыңыз, қоспаны бағанға ауыстырыңыз, 12 000 айн/мин (13 800 × г) 30 – 60 сек центрифугалаңыз.Аралас ерітіндінің көлемі >700 мкл болса, адсорбциялық бағанды қайтадан жинау түтігіне салыңыз, қалған ерітіндіні адсорбциялық бағанға ауыстырыңыз және 12 000 айн/мин (13 800 × г) 30 – 60 сек центрифугалаңыз.
4. Келесі өнімділік 08-1/Gel экстракциясы бағдарламасының 5 – 8 қадамдарына қатысты.
Қолданбалар
TAE немесе TBE агароза гелінің әртүрлі концентрациясы;ПТР өнімдері, ферментативті реакция жүйелері немесе әртүрлі әдістермен алынған басқа да шикі ДНҚ өнімдері.Қалпына келтірілген фрагменттердің аралығы болды70 bp -20 кб.
Ескертпелер
Тек зерттеуге арналған.Диагностикалық процедураларда қолдануға болмайды.
1. Қолданар алдында затбелгіде көрсетілгендей GW буферін сұйылту үшін 80 мл этанол қосыңыз, бөлме температурасында сақтаңыз.
2. Егер буфердің ЖІӨ төмен температурада сақтау кезінде тұндыру оңай болса, оны қолданар алдында белгілі бір уақыт кезеңі ішінде бөлме температурасында орналастыруға болады.Қажет болса, оны тұнба толығымен ерігенше 37℃ су моншасында алдын ала қыздыруға болады, содан кейін оны араластырғаннан кейін пайдалануға болады.
3. Су моншасының температурасын алдын ала 50 ~ 55℃ етіп орнатыңыз.
4. 08-1/Gel экстракция бағдарламасының 1-қадамында гель тілігінің өлшемін азайту еріту уақытын едәуір қысқартады және қалпына келтіру тиімділігін арттырады (линияланған ДНҚ жоғары температурада үздіксіз әсер еткенде оңай гидролизденеді).ДНҚ гелін ұзақ уақыт бойы ультракүлгін сәулелерге ұшыратпаңыз, себебі ультракүлгін сәуле ДНҚ-ны зақымдауы мүмкін.
5. Гельді 08-1/Gel экстракция бағдарламасының 2-қадамында толығымен ерітіңіз, әйтпесе ДНҚ қалпына келтіру тиімділігіне айтарлықтай әсер етеді.
6. Элюция буферін немесе ddH2O 55℃ дейін алдын ала қыздырыңыз, бұл ДНҚ элюциясы тиімділігін арттыруға көмектеседі.ДНҚ-ны 2,5 мМ Tris-HCl, рН 7,0 – 8,5 элюентте сақтау ұсынылады.
