EndoFree Plasmid Maxi жинағы

Сақтау шарттары

RNaseA -30 ~ -15℃ температурада сақталуы және ≤0℃ температурада тасымалдануы керек.

Эндотоксинді тазартқышты бір ай бойы 2 ~ 8 ℃ температурада сақтауға болады, ұзақ сақтау үшін -30 ~ -15 ℃ температурада сақтауға болады.және ≤0℃ кезінде тасымалданады.

Басқа компоненттер бөлме температурасында (15 ~ 25 ℃) сақталуы керек және бөлме температурасында тасымалдануы керек.

Құрамдас бөліктер

RNaseA:10 мг/мл, РНҚ-ны жою үшін қолданылады.

P1 буфері:бактериялық суспензия буфері, бірінші қолданар алдында P1 буферіне RNaseA қосыңыз.

P2 буфері:бактериялық лизис буфері (құрамында SDS/NaOH бар).

P4 буфері:бейтараптандыру буфері.

Эндотоксинді тазартқыш:шикі плазмид сығындысынан эндотоксинді тиімді жою.

Буфер PW:буферді жуыңыз, бірінші қолданар алдында этанолдың белгіленген көлемін қосыңыз.

Буферлік туберкулез:элюционды буфер.

FastPure DNA Maxi бағандары:плазмидті ДНҚ адсорбциялық бағандары.

Коллекциялық түтіктер 50 мл:фильтраттарды жинау түтіктері.

Эндотоксинсіз жинау түтігі:плазмидті ДНҚ жинау түтіктері.

Дайын материалдар

Абсолютті этанол, изопропанол, 50 мл дөңгелек түбі бар центрифуга түтіктері және 50 мл эндотоксинсізцентрифугалық түтіктер.

Қолданбалар

Бұл өнім 150 - 300 мл бактериялық ерітіндіден плазмидтерді ауқымды экстракциялау үшін жарамды.түнде мәдени.

Эксперимент процесі

1. Түнде өсірілген 150 – 200 мл (300 мл-ден көп емес) бактериялық ерітіндіні алыңыз және центрифугалаңыз.шамамен 11 000 айн/мин (12 000 × г) 1 – 2 мин.Супернатантты тастаңыз және бактерияларды жинаңыз.

Δ 50 мл-ден астам бактериялық ерітіндіні жинаған кезде, бактерияларды бактериялық ерітінді қосу, центрифугалау, үстіңгі затты тастау және сол 50 мл түтіктегі басқа қадамдар арқылы жинауға болады.

бірнеше рет.

2. Центрифугаға 7,5 мл буфер P1 қосыңыз (RNaseA буферіне P1 қосылғанын тексеріңіз)бактериялары бар түтікке салып, құйынды немесе тамшуыр арқылы мұқият араластырыңыз.

Δ Бұл қадамдағы бактериялардың толық қайта суспензиясы өнім алу үшін өте маңызды және қайта суспензиядан кейін бактериялардың шоғырлары болмауы керек.Мұқият араласпаған бактериялардың шоғырлары болса, ол лизиске әсер етеді, нәтижесінде өнімділік пен тазалық төмен болады.Егер бактериалды ерітіндінің OD600 мәні 0,65 болса, 150 мл бактериалды ерітіндіден экстракциялау кезінде 7,5 мл P1 буферін қолдану ұсынылады;OD600 0,75 болғанда, 8 мл P1 буферін пайдалану керек және P2 және P4 буферлерінің көлемдерін сәйкесінше өзгерту керек.Егер бактериялық ерітіндінің көлемі 200 мл-ге дейін ұлғайса, оны қолдану ұсыныладыP1, P2 және P4 буферлерінің көлемі пропорционалды түрде көбейтіледі.

3. 2-қадамдағы бактериялық суспензияға 7,5 мл P2 буферін қосып, 6 – 8 дейін ақырын жоғары және төмен араластырыңыз.рет және бөлме температурасында 4 – 5 минут инкубациялаңыз.

Δ Мұқият араластыру үшін ақырын төңкеріңіз.Құйынды ДНҚ геномдық фрагментациясын тудырады, нәтижесінде алынған плазмидада геномдық ДНҚ фрагменттері пайда болады.Бұл кезде ерітінді тұтқыр және мөлдір болады, бұл бактериялардың толығымен лизистен өткенін көрсетеді.Плазмидалардың жойылуын болдырмау үшін ұзақтығы 5 минуттан аспауы керек.Егер ерітінді мөлдір болмаса, нәтижесінде бактериялар тым көп болуы мүмкінтолық емес лизис, сондықтан бактериялардың мөлшерін тиісті түрде азайту керек.

4. 3-қадамдағы бактериялық суспензияға 7,5 мл P4 буферін қосыңыз және ерітінді Р2 буферін толығымен бейтараптандыруға мүмкіндік беру үшін дереу ақырын 6 – 8 рет төңкеріңіз.Бұл кезде ақ флокулентті тұнба пайда болуы керек.Шамамен 11 000 айн/мин (12 000 × г) 10 – 15 минут бойы центрифугалаңыз, үстіңгі затты жаңа 50 мл дөңгелек түбі бар центрифуга түтігіне (өздігінен дайындалған) абайлап тамызыңыз жәнеқалқымалы ақ тұнбаны сорып алыңыз.

Δ P4 буферін қосып, жақсылап араластыру үшін бірден аударыңыз.Бейтараптандыруға әсер ететін жергілікті жауын-шашынның пайда болуына жол бермеу үшін ақ тұнба ерітіндінің бойына біркелкі тарағанша түтікшені қалдырыңыз.Егер центрифугалау алдында біркелкі ақ флокулентті тұнба болмаса және центрифугалаудан кейін үстіңгі қабат мөлдір болмаса, түтікшенітағы 5 мин центрифугалайды.

5. 4-қадамдағы үстіңгі қабатқа эндотоксин тазартқышты 0, 1 есе көлемде (үстіңгі қабат көлемінің 10%, шамамен 2,2 мл) қосыңыз және араластыру үшін төңкеріңіз.Ерітіндіні мұзды ваннаға салыңыз немесе ұнтақталған мұзға (немесе тоңазытқыштың мұздатқышына) ерітінді бұлыңғырдан мөлдір және мөлдір болып өзгергенше 5 минутқа салыңыз.сәл бұлыңғыр), кейде бірнеше рет араластырыңыз.

Δ Эндотоксинді тазартқышты үстіңгі қабатқа қосқаннан кейін үстіңгі қабат бұлыңғыр болады, бірақмұз ваннасында салқындағаннан кейін үстіңгі қабат мөлдір (немесе аздап бұлыңғыр) болуы керек.

6. Үстіңгі қабат бөлме температурасында (>25℃) 10 – 15 минутқа қойылғаннан кейін ол лайланып қалады.оның температурасы бөлме температурасына дейін көтеріледі.Содан кейін супернатантты араластыру үшін төңкеру керек.

Δ Бөлме температурасы төмен болса немесе экстракция уақытын қысқартқыңыз келсе, үстіңгі затты 37 ~ 42 ℃ су моншасында 5 – 10 минут ішінде инкубациялауға болады және келесі қадамды үстіңгі заттан кейін орындауға болады.бұлыңғыр болады.

7. Фазаны бөлу үшін үстіңгі затты шамамен 11 000 айн/мин (12 000 × г) бөлме температурасында 10 минут бойы центрифугалаңыз (температура >25℃ болуы керек).Жоғарғы сулы фазада ДНҚ, ал төменгі көк майлы фаза қабатында эндотоксин және басқа қоспалар бар.аударыңызҚұрамында ДНҚ бар сулы фаза жаңа түтікке жәнемайлы қабатты тастаңыз.

Δ Центрифугалау кезінде температура 25℃-ден жоғары болуы керек, өйткені тиімді фазаны бөлу болмайдытемпература тым төмен болса пайда болады.

Δ Фазаны бөлу тиімді болмаса, центрифугалау температурасын 30℃ дейін реттеуге болады жәнецентрифугалау уақытын 15 минутқа дейін арттыруға болады.

Δ Көк майлы қабатты сормаңыз, өйткені оның құрамында эндотоксин және басқа қоспалар бар.

Механизм

Ресуспензия лизисін бейтараптандыру

◇ 7,5 мл P1 буферін қосыңыз

◇ 7,5 мл P2 буферін қосыңыз

◇ 7,5 мл P4 буферін қосыңыз

Эндотоксинді жою

◇Эндотоксинді тазартқыштың үстіңгі қабатынан 0. 1 есе артық қосыңыз

Түптеу және жуу

◇ 0,5 есе көп изопропанолды қосыңыз

◇ 10 мл буфер PW қосыңыз