M-MLV Neoscript кері транскриптаза
Neoscript кері транскриптаза – Moloney тышқан лейкозы вирусының шығу тегі мен E.coli экспрессиясының M-MLV генінің мутация скринингі арқылы алынған кері транскриптаза.Фермент RNase H белсенділігін жояды, жоғары температураға төзімділікке ие және жоғары температурадағы кері транскрипцияға жарамды.Сондықтан ол РНҚ-ның жоғары деңгейлі құрылымының және спецификалық емес факторлардың кДНҚ синтезіне қолайсыз әсерлерін жоюға көмектеседі және жоғары тұрақтылық пен кері транскрипция синтезі қабілетіне ие.Ферменттің тұрақтылығы жоғары және кері транскрипция синтезі қабілеті бар.
Құрамдас бөліктер
1.200 U/мкл Neoscript кері транскриптаза
2.5 × Бірінші тізбекті буфер (міндетті емес)
* 5 × Бірінші тізбек буферінде dNTP жоқ, реакция жүйесін дайындаған кезде dNTP қосыңыз.
Ұсынылатын қолданба
1.Бір сатылы qRT-ПТР.
2.РНҚ вирусын анықтау.
Сақтау жағдайы
Ұзақ мерзімді сақтау үшін -20°C, қолданар алдында жақсылап араластыру керек, жиі мұздату-ерітуден аулақ болу керек.
Бірлік анықтамасы
Бір бірлік поли(A)•oligo(dT) көмегімен 37°C температурада 10 минут ішінде 1 нмоль dTTP қосады.25үлгі/праймер ретінде.
Сапа бақылауы
1.SDS-PAGE электрофоретикалық тазалығы 98%-дан жоғары.
2.Күшейтудің сезімталдығы, партиядан партияға бақылау, тұрақтылық.
3.Экзогендік нуклеаза белсенділігі жоқ, экзогендік эндонуклеаза немесе экзонуклеаза ластануы жоқ
Бірінші тізбекті реакция ерітіндісі үшін реакцияны орнату
1.Реакциялық қоспаны дайындау
| Құрамдас бөліктер | Көлемі |
| Олиго(дТ)12-18 Праймер немесе Кездейсоқ праймера Немесе генге тән праймерлерb | 50 моль |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 сағ | |
| 10 мМ dNTP | 1 мкл |
| Үлгі РНҚ | Жалпы РНҚ≤ 5мкг;мРНҚ≤ 1 мкг |
| RNase жоқ dH2O | 10 мкл дейін |
Ескертулер:a/b: эксперименттік қажеттіліктеріңізге сәйкес праймерлердің әртүрлі түрлерін таңдаңыз.
2.65°C температурада 5 минут қыздырыңыз және мұзда 2 минут бойы жылдам суытыңыз.
3.Төмендегі компоненттерді жоғарыда аталған жүйеге жалпы көлемі 20 мкл дейін қосып, ақырын араластырыңыз:
| Құрамдас бөліктер | Көлемі (мкл) |
| 5 × Бірінші тізбекті буфер | 4 |
| Neoscript кері транскриптаза (200 U/мкл) | 1 |
| RNase ингибиторы (40 U/мкл) | 1 |
| RNase жоқ dH2O | 20 мкл дейін |
4. Реакцияны келесі шарттарға сәйкес орындаңыз:
(1) Кездейсоқ праймер пайдаланылса, реакцияны 25℃ температурада 10 минут, содан кейін 50℃ температурада 30~60 минут ішінде жүргізу керек;
(2) Oligo dT немесе арнайы праймерлер пайдаланылса, реакцияны 50℃ температурада 30~60 минут ішінде жүргізу керек.
5.Neoscript кері транскриптазаны инактивациялау және реакцияны тоқтату үшін 95℃ температурада 5 минут қыздырыңыз.
6.Кері транскрипция өнімдері тікелей ПТР реакциясында және флуоресценттік сандық ПТР реакциясында қолданылуы мүмкін немесе -20℃ температурада ұзақ уақыт сақталады.
ПТР Рәрекет:
1.Реакциялық қоспаны дайындау
| Құрамдас бөліктер | Шоғырлану |
| 10 × ПТР буфері (dNTP бос, Mg²+ бос) | 1× |
| dNTP (әрбір dNTP 10 мМ) | 200 мкм |
| 25 мМ MgCl2 | 1-4 мМ |
| Taq ДНҚ полимераза (5U/мкл) | 2-2,5 U |
| 1-праймер (10 мкм) | 0,2-1 мкм |
| 2-праймер (10 мкм) | 0,2-1 мкм |
| Үлгіа | ≤10% Бірінші тізбекті реакция ерітіндісі (2 мкл) |
| ddH2O | 50 мкл дейін |
Ескертулер:a: Тым көп бірінші тізбекті реакция ерітіндісі қосылса, ПТР реакциясы тежелуі мүмкін.
2.ПТР реакциясының процедурасы
| Қадам | Температура | Уақыт | Циклдер |
| Алдын ала денатурация | 95℃ | 2-5 мин | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 10-20 сек | 30-40 |
| Күйдіру | 50-60℃ | 10-30 сек | |
| Кеңейтім | 72℃ | 10-60 сек |
Ескертпелер
1.42℃~55℃ аралығындағы кері транскрипция температурасын оңтайландыру үшін қолайлы.
2.Ол жақсы тұрақтылыққа ие, жоғары температурадағы кері транскрипцияны күшейтуге жарамды.Сонымен қатар, ол РНҚ-ның күрделі құрылымдық аймақтары арқылы тиімді өтуге қолайлы.Сондай-ақ, олбір сатылы мультиплексті флуоресценцияның сандық RT-ПТР анықтауы үшін қолайлы.
3.Әртүрлі ПТР күшейту ферменттерімен жақсы үйлесімділік және жоғары сезімталдық RT-ПТР реакциялары үшін қолайлы.
4.Жоғары сезімталдықтың бір сатылы флуоресценциялық сандық RT-ПТР реакциясы үшін қолайлы, шаблондардың төмен концентрациясын анықтау жылдамдығын тиімді жақсартады.
5.cDNA кітапханасын құру үшін қолайлы.
