Рназа ингибиторы
Тышқан RNase ингибиторы - E.coli-ден экспрессияланған және тазартылған рекомбинантты тышқан RNase ингибиторы.Ол ковалентті емес байланыс арқылы RNase A, B немесе C 1:1 қатынасында байланысады, осылайша үш ферменттің белсенділігін тежейді және РНҚ-ны деградациядан қорғайды.Дегенмен, ол RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H немесе Aspergillus RNase-ге қарсы тиімді емес.Муриндік RNase тежегіші RT-PCR, RT-qPCR және IVT mRNA арқылы сыналған және әртүрлі коммерциялық кері транскриптазалармен, ДНҚ полимеразаларымен және РНҚ полимеразаларымен үйлесімді болды.
Адамның RNase тежегіштерімен салыстырғанда, тышқан RNase тежегішінде ингибитордың инактивациясын тудыратын тотығуға жоғары сезімтал екі цистеин жоқ.Бұл оны DTT төмен концентрацияларында (1 мМ-ден аз) тұрақты етеді.Бұл мүмкіндік оны DTT жоғары концентрациясы реакцияға теріс әсер ететін реакцияларда қолдануға жарамды етеді (мысалы, нақты уақыттағы RT-ПТР).
Aқолдану
Бұл өнімді РНҚ деградациясын болдырмау үшін RNase кедергісі мүмкін болатын кез келген тәжірибеде кеңінен қолдануға болады, мысалы:
1.кДНҚ-ның бірінші тізбегінің синтезі, RT-ПТР, RT-qPCR және т.б.
2.In vitro транскрипция/трансляция кезінде РНҚ-ны деградациядан қорғайды (мысалы, in vitro вирустық репликация жүйесі).
3.РНҚ бөлу және тазарту кезінде РНҚ белсенділігінің тежелуі.
Сақтау шарттары
Өнімді -25～-15 ℃ температурада сақтауға болады, жарамдылық мерзімі 2 жыл.
Сақтау буфері
50 мМ KCl, 20 мМ HEPES-KOH (рН 7,6, 25 ℃), 8 мМ DTT және 50% глицерин.
Бірлік анықтамасы
5 нг рибонуклеаза А белсенділігін 50% тежеу үшін қажетті тышқан RNase тежегішінің мөлшері бір бірлік (U) ретінде анықталды.
Ақуыздың молекулалық салмағы
Тышқан RNase ингибиторының молекулалық салмағы 50 кДа құрайды.
Сапа бақылауы
Экзонуклеаза Белсенділік:
1 мкг λ -Hind III дайджест ДНҚ-сы бар 40 U тышқан RNase ингибиторы 37℃ температурада 16 сағат бойы агарозды гель электрофорезі арқылы анықталған деградацияны бермейді.
Эндонуклеаза белсенділігі:
16 сағат бойы 37℃ температурада 1μ г λ ДНҚ бар тышқан RNase ингибиторының 40 U, агарозды гель электрофорезі арқылы анықталған деградацияны бермейді.
Никлеу Белсенділік:
16 сағат бойы 37℃ температурада 1μг pBR322 бар 40U тышқан RNase ингибиторы агарозды гель электрофорезімен анықталғандай деградацияны бермейді.
RNase Белсенділік:
37℃ температурада 4 сағат бойы 1,6μг MS2 РНҚ бар 40U тышқан RNase ингибиторы агарозды гель электрофорезі арқылы анықталғандай деградацияны бермейді.
E.coli ДНҚ:
40 U тышқан RNase ингибиторы E. coli 16S rRNA локусына тән праймерлері бар TaqMan qPCR көмегімен E. coli геномдық ДНҚ бар-жоғына тексеріледі.E. coli геномдық ДНҚ ластануы ≤ 0,1 пг/40 U.
Nотеs
1. Күшті тербеліс немесе араластыру ферменттің инактивациясына әкеледі.
2. Бұл ингибитордың оңтайлы температура диапазоны 25-55 ℃ болды және ол 65 ℃ және одан жоғары температурада инактивацияланды.
3. RNase H, RNase 1 және RNase T1 белсенділігі тышқан RNase ингибиторымен тежелген жоқ.
4. RNase белсенділігінің тежелуі рН кең диапазонында (рН 5-9 барлығы белсенді) табылды, ал ең жоғары белсенділік рН 7-8 кезінде байқалды.
5. Рибонуклеазалар әдетте денатурациялау жағдайында белсенділікті сақтайтындықтан, рибонуклеазамен комплексті РНҚ ингибиторы молекулаларының денатурациялануын болдырмау үшін абай болу керек.Белсенді рибонуклеазаның бөлінуін болдырмау үшін 50 °C жоғары температурадан және мочевина немесе басқа денатурациялаушы агенттердің жоғары концентрациясынан аулақ болу керек.
