M-MLV кері транскриптаза
RevScript Кері транскриптаза гендік инженерия технологиясы арқылы алынған.Оның кДНҚ синтездеу қабілеті жоғары, термиялық тұрақтылық және реакция температурасының шегі (60°C дейін).Синтезделген кДНҚ өнімі 10 кб дейін.Ол шаблондардың жақындығын арттырады және күрделі қайталама құрылымы немесе төмен көшірме гендері бар РНҚ үлгілерінің кері транскрипциясы үшін қолайлы.
Құрамдас бөліктер
| Құрамдас | HC2003 В (10 000U) | HC2003 В (5*10 000U) | HC2003 В (200 000U) |
| RevScript кері транскриптаза (200U/мкл) | 50 мкл | 5×50 мкл | 1 мл |
| 5 × RevScript буфері | 250 мкл | 1,25 мл | 5 мл |
Сақтау жағдайы
Бұл өнімді -25°C~-15°C температурада 2 жыл бойы сақтау керек.
Бірлік анықтамасы
Бір қондырғы 1 нмоль dTTP қышқылда ерімейтін материалға 37°C температурада праймер ретінде Oligo(dT) көмегімен 10 минут ішінде қосады.
Реакцияны орнату
1.РНҚ шаблонының денатурациясы (Бұл қадам міндетті емес, РНҚ шаблонының денатурациясы екінші реттік құрылымдарды ашуға көмектеседі, бұл бірінші тізбекті кДНҚ шығымын жақсартады.)
| Құрамдас бөліктер | Көлемі (мкл) |
| RNase бос ddH2O | 13-ке |
| Олиго(дТ)18 (50 мкмоль/л) немесе Кездейсоқ праймер (50 мкмоль/л) Немесе генге тән праймерлер (2 мкмоль/л) | 1 |
| немесе 1 | |
| немесе 1 | |
| РНҚ үлгісі | X a |
Ескертулер:
1) а: Жалпы РНҚ: 1-5 мг немесе мРНҚ: 1-500 нг
2) 65°C температурада 5 минут инкубациялау, содан кейін бірден мұзға 2 минут салқындату.Реакция сұйықтығын жинау үшін қысқа центрифугалау, келесі кестеде көрсетілгендей кері транскрипция реакциясының ерітіндісін қосыңыз.Араластыру үшін тамшуырмен ақырын.
1.Реакциялық қоспаны дайындау (көлемі 20 мкл)
| Құрамдас бөліктер | Көлемі (мкл) |
| Алдыңғы қадамның қоспасы | 13 |
| 5×Буфер | 4 |
| dNTP қоспасы (10нмоль/л) | 1 |
| Кері транскриптаза (200 U/мкл) | 1 |
| RNase ингибиторы (40 U/мкл) | 1 |
1.Реакцияны келесі шарттарда орындаңыз:
| Температура (°C) | Уақыт |
| 25 °Ca | 5мин |
| 42 °Cb | 15-30 мин |
| 85 °Cc | 5мин |
Ескертулер:
1) а.25°C температурада 5 минут бойы инкубациялау тек кездейсоқ гексамерлерді пайдалану үшін қажет.Oligo (dT) пайдалану кезінде бұл қадамды өткізіп жіберіңіз.18немесе генге тән праймер.
2) б.Ұсынылған кері транскрипция температурасы 42°C, Күрделі қайталама құрылымдары немесе жоғары GC мазмұны бар шаблондар үшін реакция температурасын 50-55°C дейін көтеру ұсынылады.
3) в.Кері транскриптазаны инактивациялау үшін 85°C температурада 5 минут қыздыру.
4) Өнімді ПТР немесе qPCR реакцияларында тікелей қолдануға болады немесе қысқа мерзімді сақтау үшін -20°C температурада сақтауға болады.Ұзақ уақыт сақтау үшін өнімдерді алгуттатып, -80°C температурада сақтау ұсынылады.Жиі мұздату-ерітуден аулақ болыңыз.
5) Өнім бір сатылы RT-qPCR үшін жарамды, әрбір 25 мкл реакция жүйесі үшін 10-20 U кері транскриптазаны қосу немесе нақты жағдайға сәйкес кері транскриптаза мөлшерін біртіндеп арттыру ұсынылады.
Ескертпелер
1.Эксперимент алаңын таза ұстаңыз;Жұмыс кезінде таза қолғап пен маска кию керек.Экспериментте пайдаланылған барлық шығын материалдары RNase ластануын болдырмау үшін RNase болмауы керек.
2.РНҚ деградациясын болдырмау үшін барлық процедураларды мұзда орындау керек.
3.Кері транскрипцияның жоғары тиімділігін қамтамасыз ету үшін жоғары сапалы РНҚ үлгілері ұсынылады.
4.Бұл өнім тек зерттеуге арналған.
5.Қауіпсіздігіңіз үшін зертханалық халатпен және бір рет қолданылатын қолғаппен жұмыс жасаңыз.
