Өсімдікке тікелей ПТР жинағы

Мысықтың №: HCR2020A

Plant Direct ПТР жинағы өсімдік жапырақтарын, тұқымдарын және т.б. тікелей күшейту үшін жарамды және құрамында полисахаридтер мен полифенолдар жоқ өсімдік үлгілерін жоғары өнімді скрининг үшін пайдалануға болады.Бағытталған эволюцияға негізделген тікелей күшейту ДНҚ полимеразасы өсімдіктердегі ПТР ингибиторларына жоғары төзімділікке ие.Сонымен бірге ол 5 кб ішінде ДНҚ фрагменттерін күшейту үшін қолайлы жоғары күшейту өнімділігін сақтайды.Жинақтағы бірегей лизис буфері А жаңа немесе мұздатылған өсімдік тіндерін лизис үшін пайдалануға болады.Оны пайдалану оңай және лизат тазартусыз күшейту үшін үлгі ретінде пайдаланылуы мүмкін.Жүйеде шикі үлгілерді қайталап мұздату және ерітуден кейін тиімді күшейтуге мүмкіндік беретін қорғаныс агенттері бар.2 × Plant Direct Master Mix күшейту реакциясын орындау үшін тек праймерлер мен үлгілерді қосуы керек, осылайша тамшуыр операцияларын азайтады және анықтау өткізу қабілетін және нәтижелердің қайталануын жақсартады.

Құрамдас бөліктер

*Өсімдіктің тікелей лизисі B буфері қосымша реагент болып табылады, ол үлгілерді сақтау уақытын ұзарту үшін өсімдіктің тікелей лизисі А буферін бейтараптандыру үшін пайдаланылады.Оны нақты жағдайға сәйкес пайдалануға болады.

Сақтау шарттары

2 × Plant Direct Master Mix, -30 ~ -15℃ температурада сақтаңыз және қайталанатын мұздату мен ерітуді болдырмаңыз;Өсімдіктің тікелей лизис буфері, -30 ~ -15℃ немесе 2 ~ 8℃ температурада сақтаңыз.

Эксперимент процесі

Үлгіні өңдеу–Өсімдік жапырағы

Тікелей әдіс:Жас жапырақтарды пайдалану ұсынылады.Кішкентай және біркелкі үлгіні алу үшін бекітілген диаметрі 0,5 – 3 мм тескіш қолданыңыз, содан кейін үлгіні ПТР жүйесіне тікелей қосыңыз (50 мкл жүйесі ұсынылады).Назар аударыңыз, үлгі түтік қабырғасына қарсы емес, ПТР ерітіндісінде екеніне көз жеткізіңіз.Ұзын фрагменттерді және күрделі үлгілерді күшейту үшін тікелей ПТР пайдаланылса, үлгі ретінде диаметрі кішірек үлгіні (0,5 – 1 мм) пайдалану жақсы нәтижелерге қол жеткізуге көмектеседі.

Ұнтақтау лизисі әдісі:Жас жапырақтарды пайдалану ұсынылады.Жапырақтың кішкене бөлігін (диаметрі шамамен 1 – 3 мм) алыңыз, оны 20 мкл Plant Direct Lysis Buffer Ab ішіне салыңыз және оны мүмкіндігінше ұнтақтаңыз (бұл қадамды 100 мкл тамшуыр ұшымен жапырақты сығу арқылы жасауға болады. үлгіні езбеу үшін).Жапырақ тінінің үлкен көлемі пайдаланылса (7 мм-ден аспайды), сұйылту буферінің көлемін 50 мкл дейін арттырыңыз.Жапырақтары ұнтақталғаннан кейін ерітінді жасыл болып көрінуі керек.Қысқа центрифугалаудан кейін реакция үлгісі ретінде ПТР жүйесіне 1 мкл үстіңгі затты қосыңыз.

Термиялық лизис әдісі:Жас жапырақтарды пайдалану ұсынылады.Жапырақтың кішкене бөлігін (диаметрі шамамен 1 – 3 мм) алыңыз, оны 20 мкл зауыттық тікелей лизис буферіне салып, 95°C температурада 5 – 10 минут қыздырыңыз.Лизис уақытын лизисі қиын жапырақтар үшін тиісті түрде ұзартуға болады (20 минуттан аспайды).Жапырақ тінінің үлкен көлемі пайдаланылса (7 мм-ден аспайды), сұйылту буферінің көлемін 50 мкл дейін арттырыңыз.Қыздырғаннан кейін қысқа центрифугалаңыз және реакция үлгісі ретінде ПТР жүйесіне 1 мкл супернатант қосыңыз.

Үлгіні өңдеу- Өсімдік тұқымы

Ұнтақтау лизисі әдісі:Диаметрі 5 мм тұқымдарды кесу үшін скальпельді пайдаланыңыз, оларды 100 мкл Plant Direct Lysis Buffer A қосыңыз және үлгіні тамшуыр ұшымен немесе басқа құралдармен ұнтақтаңыз.Қысқаша құйып, бөлме температурасында 3-5 минутқа қалдырыңыз.Тұқым үлгісі сұйылту буферіне батырылғанына көз жеткізіңіз.Қысқа центрифугалаудан кейін реакция үлгісі ретінде ПТР жүйесіне 1 мкл үстіңгі затты қосыңыз.

Термиялық лизис әдісі:Диаметрі 5 мм тұқымдарды кесу үшін скальпельді пайдаланыңыз, оларды 100 мкл Plant Direct Lysis Buffer A қосыңыз және 95°C температурада 5 – 10 минут қыздырыңыз.Лизис уақытын лизисі қиын жапырақтар үшін сәйкесінше ұзартуға болады (30 минуттан аспайды).Қыздырғаннан кейін қысқа центрифугалаңыз және реакция үлгісі ретінде ПТР жүйесіне 1 мкл үстіңгі затты қосыңыз.

а.Сәйкес өлшемдегі үлгілерді кесу үшін қайшыны немесе басқа құралдарды пайдалануға болады;егер пуансон немесе қайшы қайта пайдаланылса, үлгілер арасында айқаспалы ластануды болдырмау үшін оларды әр қолданар алдында 2% натрий гипохлорит ерітіндісімен тазалау керек.

б.Қолданар алдында зауыттың тікелей лизис буферінің толығымен ерігеніне көз жеткізіңіз.Егер буфер тұтқыр немесе тұнбалары болса, оны қолданар алдында оны толығымен еріту үшін 37℃ температурада қыздыруға болады.

в.Реакция жүйесіндегі шаблон көлемін өсімдік материалы мен қосылған еріткіш көлемінің айырмашылығына сәйкес сәйкес реттеуге болады.

Өсімдіктің тікелей лизис буфері

Бұл өнімдегі өсімдіктің тікелей лизис буфері А өсімдік ұлпаларының көпшілігінің геномын шығару үшін қатаң оңтайландырылған және шикі өсімдіктерді 4℃ температурада қысқа мерзімді сақтауға жарамды.Үлгіні ұзақ уақыт бойы (мысалы, 1 – 2 ай) сақтау қажет болса, үстіңгі затты жаңа EP түтігіне ауыстырып, оны -20℃ температурада сақтау ұсынылады.Үлгілерді тұрақтырақ сақтау үшін тасымалданатын үстіңгі затқа бірдей көлемде Plant Direct Lysis Buffer B қосыңыз, жақсылап араластырыңыз және -20℃ температурада сақтаңыз.Тұрақты сақтау уақыты өсімдік үлгілері мен күйлеріне байланысты өзгереді.

Реакция жүйесі

а.Оның құрамында Mg²⁺2 мМ соңғы концентрацияда.

б.Әрбір праймер үшін 0,4 мкм соңғы концентрацияны пайдалану ұсынылады.Праймерлерді шамадан тыс пайдалану спецификалық емес күшейтудің жоғарылауына әкеледі.

в.Қолданылатын үлгінің көлемін нақты жағдайға сәйкес реттеуге болады.Шикі лизденген үлгінің бір реакциясында қолданылатын мөлшерді реакцияның жалпы көлемінің 2%-20%-ы арасында реттеуге болады.Тым көп үлгілерді пайдалану күшейтудің сәтсіздігін тудыруы мүмкін.

Реакция бағдарламасы

а.Бастапқы денатурация (98℃, 5 мин) ПТР күшейту үшін қолдануға болатын геномдық ДНҚ-ны босатып, өсімдік тінінің лизисіне ықпал етеді.Уақытты қысқартпаңыз немесе температураны төмендетпеңіз.

б.Оны праймердің Tm мәніне тең немесе Tm мәнінен 2 ~ 4℃ жоғары орнату ұсынылады.Бұл өнімде қолданылатын тікелей күшейту ДНҚ полимеразасы кәдімгі Taq ДНҚ полимеразасынан ерекшеленеді және реакцияның жасыту температурасына арнайы талаптары бар; жоғары жасыту температурасын пайдалану спецификалық емес күшейтуді тиімді төмендетеді және күшейту тиімділігін арттырады.Күрделі үлгілер үшін жасыту температурасын реттеу және ұзарту уақытын ұзарту арқылы тиімді күшейтуге қол жеткізуге болады.

в.Егер күшейту өнімінің ұзындығы ≤1 кб болса, ұзарту уақыты 30 сек/кб болып белгіленеді;егер күшейту өнімінің ұзындығы >1 кб болса, ұзарту уақыты 60 сек/кб етіп орнатылады.

d.Күрделі үлгілер немесе күшейту шығымы төмен үлгілер үшін циклдар санын сәйкесінше 40 -50 циклге дейін арттыруға болады.

Қолданбалар

Ол өсімдік тіндерін тікелей күшейту және құрамында полисахаридтер мен полифенолдар жоқ өсімдік үлгілерін жоғары өнімді скрининг үшін қолданылады.

Ескертпелер

Тек зерттеуге арналған.Диагностикалық процедураларда қолдануға болмайды.

1. Өсімдікті шикі күшейту немесе тікелей күшейту үшін жүйенің, праймерлер мен операциялардың дұрыстығына көз жеткізу үшін экспериментті бастамас бұрын оң бақылау ретінде тазартылған геномдық ДНҚ пайдалану ұсынылады.

2. Бұл жинақта қолданылатын тікелей күшейту ДНҚ полимеразасы күшті түзету белсенділігіне ие.ТА клондау қажет болса, аденинді қоспас бұрын ДНҚ-ны тазарту ұсынылады.

3. Праймер дизайны бойынша нұсқаулық:

а.Праймердің 3′ ұшындағы соңғы негіз G немесе C болуы керек.

б.Праймердің 3′ соңындағы соңғы 8 негізде дәйекті сәйкессіздіктерге жол бермеу керек.в.Праймердің 3′ ұшында шаш қыстырғыш құрылымдарын болдырмаңыз.

d.Алға және кері праймердің Tm мәніндегі айырмашылықтар 1℃ аспауы керек және Tm мәнін 60 ~ 72℃ етіп реттеу керек (Tm мәнін есептеу үшін Primer Premier 5 ұсынылады).

e.Үлгімен сәйкес келмейтін қосымша қосымша праймер тізбегі праймер Tm мәнін есептеу кезінде қосылмауы керек.

f.Праймердің GC мазмұны 40% -60% болуы ұсынылады.

g.Праймердегі A, G, C және T-ның жалпы таралуы мүмкіндігінше біркелкі болуы керек.GC немесе AT мазмұны жоғары аймақтарды пайдаланбаңыз.

h.Праймер ішінде немесе екі праймер арасында 5 немесе одан да көп негіздердің қосымша тізбегінің болуына жол бермеңіз және екі праймердің 3′ ұшында 3 немесе одан да көп негіздердің қосымша реттілігінің болуына жол бермеңіз.

мен.Арнайы емес күшейтуді болдырмау үшін праймердің ерекшелігін тексеру үшін NCBI BLAST функциясын пайдаланыңыз.