Hotstart Taq ДНҚ полимеразасы
Hot Start Taq DNA Polymerase (Антидененің модификациясы) - бұл 5′→3′ полимераза белсенділігі мен 5′ флап эндонуклеаза белсенділігі бар Thermus aquaticus YT-1 өнімінен алынған ыстықтай басталатын термотұрақты ДНҚ полимераза.Ыстық старттық Taq ДНҚ полимеразасы термолабильді Taq антиденелерімен модификацияланған Taq ДНҚ полимераза болып табылады.Антиденелерді модификациялау ПТР спецификалығын, сезімталдығын және шығымдылығын арттырды.
Құрамдас бөліктер
| Құрамдас | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq буфері | 4×1 мл | 4×10 мл | 4×50 мл | 5×400 мл |
| Ыстық старт Taq ДНҚ полимеразасы (антиденелер өзгертілген) (5 U/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 5 мл | 10×5 мл |
Қолданбалар
10 мМ Tris-HCl (25℃ температурада pH 7,4), 100 мМ KCl, 0,1 мм EDTA, 1 мм дитиотреитол, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 және 50% глицерол.
Сақтау жағдайы
0°C төмен температурада тасымалдау және -25°C~-15°C температурада сақтау керек.
Бірлік анықтамасы
Бір бірлік 75°C температурада 30 минут ішінде қышқылда ерімейтін материалға 15 нмоль dNTP қосатын ферменттің мөлшері ретінде анықталады.
Сапа бақылауы
1.Endонуклеаза белсенділігі:20 U ферментті 4 мкг pUC19 ДНҚ-мен 4 сағат бойы 37℃ температурада инкубациялау гель электрофорезімен анықталғандай ДНҚ-ның анықталатын деградациясына әкелмеді.
2.5 кб Ламбда ПТР:200 мкМ dNTPs және 0,2 мкМ праймерлердің қатысуымен 1,25 бірлік Taq DNA Polymerase бар 5 нг Ламбда ДНҚ ПТР күшейтудің 25 циклі күтілетін 5 кб өнімге әкеледі.
3.Экзонуклеаза белсенділігі:10 нмоль 5´-FAM олигонуклеотиді бар кемінде 12,5 U Taq DNA полимеразасы бар 50 мкл реакцияны 30 минут бойы 37℃ температурада инкубациялау анықталатын деградацияны бермейді.
4.RNase белсенділігі:Құрамында 20 U ферменті бар 10 мкл реакцияны 1 мкг РНҚ транскриптімен 2 сағат бойы 37°C температурада инкубациялау гельдік электрофорез арқылы анықталған РНҚ-ның анықталатын деградациясына әкелмеді.
5.Жылу инактивациясы:Жоқ.
Реакция жүйесі
| Құрамдас бөліктер | Көлемі |
| Үлгі ДНҚa | міндетті емес |
| 10 мкм Алға праймер | 0,5 мкл |
| 10 мкм кері праймер | 0,5 мкл |
| dNTP қоспасы (әрқайсысы 10 мМ) | 0,5 мкл |
| 5×HC Taq буфері | 5 мкл |
| Так ДНҚ полимеразаб(5U/мкл) | 0,125 мкл |
| Нуклеазсыз су | 25 мкл дейін |
Ескертулер:
1) а.
| ДНҚ | Сома |
| Геномдық | 1 нг-1 мкг |
| Плазмидті немесе вирустық | 1 пг-1 нг |
2) б.Taq DNA Polymerase оңтайлы концентрациясы мамандандырылған қолданбаларда 5-50 бірлік/мл (0,1-0,5 бірлік/25 мкл реакция) аралығында болуы мүмкін.
Термиялық цикл протоколы
ПТР
| Қадам | Температура(°C) | Уақыт | Циклдер |
| Бастапқы денатурацияa | 95 ℃ | 1-3мин | - |
| Денатурация | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 Цикл |
| Күйдіруб | 45-68 ℃ | 15-60 с | |
| Кеңейтім | 68 ℃ | 1кб/мин | |
| Соңғы кеңейтім | 68 ℃ | 5мин | - |
Ескертулер:
1) Көптеген күшейтулер үшін 95°C температурада 1 мин бастапқы денатурация жеткілікті.Күрделі үлгілер үшін 95°C температурада 2-3 минут ұзағырақ денатурация ұсынылады.Колониялық ПТР кезінде 95°C температурада бастапқы 5 минуттық денатурация ұсынылады.
2) Жасыту қадамы әдетте 15-60 с.Күйдіру температурасы праймер жұбының Tm мәніне негізделген және әдетте 45-68℃ болады.
