Протеиназа K mNGS (сұйықтық)
Протеиназа K – кең субстрат ерекшелігі бар тұрақты сериндік протеаза.Ол көптеген ақуыздарды табиғи күйде, тіпті жуғыш заттар болған кезде де ыдыратады.Кристалл және молекулалық құрылымды зерттеуден алынған дәлелдер ферменттің белсенді учаскелік каталитикалық триада (Asp) бар субтилизиндер тұқымдасына жататынын көрсетеді.39-Оның69- Сер224).Бөлінудің басым орны - блокталған альфа-амин қышқылдары бар алифатты және ароматты аминқышқылдарының карбоксил тобына іргелес пептидтік байланыс.Ол әдетте кең ерекшелігі үшін қолданылады.Бұл протеиназа K mNGS үшін арнайы жасалған.Басқа протеиназа K-мен салыстырғанда, оның құрамында бірдей ферменттік өнімділігі бар нуклеин қышқылының ластануы одан да азырақ, бұл mNGS-тің төменгі ағынында қолданылуын жақсырақ қамтамасыз етеді.
Сақтау шарттары
2-8℃ 2 жыл
Техникалық сипаттама
| Сыртқы түрі | Түссізден ашық қоңырға дейінгі сұйықтық |
| Белсенділік | ≥800 U/мл |
| Ақуыз концентрациясы | ≥20 мг/мл |
| Никаза | Ешқайсысы анықталмады |
| ДНаз | Ешқайсысы анықталмады |
| RNase | Ешқайсысы анықталмады |
Қасиеттер
| EC нөмірі | 3.4.21.64(Tritirachium альбомындағы рекомбинантты) |
| Изоэлектрлік нүкте | 7.81 |
| Оңтайлы рН | 7,0- 12,0 1-сурет |
| Оңтайлы температура | 65 ℃ 2-сурет |
| рН тұрақтылығы | рН 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 сағ) 3-сурет |
| Термиялық тұрақтылық | 50 ℃ төмен (рН 8,0, 30 мин) 4-сурет |
| Сақтау тұрақтылығы | 25 ℃ температурада 12 ай бойы 90% белсенділік |
| Активаторлар | SDS, мочевина |
| Ингибиторлар | диизопропилфторфосфат;фенилметилсульфонилфториді |
Қолданбалар
1. Генетикалық диагностикалық жинақ
2. РНҚ және ДНҚ экстракциялық жинақтары
3. Ұлпалардан белокты емес компоненттерді алу, ДНҚ сияқты ақуызды қоспаларды ыдыратувакциналар және гепаринді дайындау
4. Импульстік электрофорез арқылы хромосоманың ДНҚ-сын дайындау
5. Вестерн дақ
6. Ферментативті гликозилденген альбуминді реагенттер in vitro диагностикасы
Сақтық шаралары
Қолдану немесе өлшеу кезінде қорғаныс қолғаптары мен көзілдіріктерді киіңіз және қолданғаннан кейін жақсы желдетіңіз.Бұл өнім терінің аллергиялық реакциясын және көздің қатты тітіркенуін тудыруы мүмкін.Деммен жұтса, ол аллергия немесе демікпе белгілерін немесе ентігуді тудыруы мүмкін.Тыныс алу жолдарының тітіркенуін тудыруы мүмкін.
Бірлік анықтамасы
Бір бірлік (U) 1 мкмоль алу үшін казеинді гидролиздеуге қажетті фермент мөлшері ретінде анықталады.келесі жағдайларда минутына тирозин.
Реагенттерді дайындау
I реагент: 1 г сүт казеин 50 мл 0,1 М натрий фосфат ерітіндісінде (рН 8,0) ерітілді, 65-70 ℃ суда 15 минут бойы инкубацияланды, араластырылды және ерітілді, сумен салқындатылды, натрий гидроксидімен рН 8,0 деңгейіне дейін реттеледі және бекітілген көлемге келтірілді. 100 мл.
II реагент: 0,1М үшхлорсірке қышқылы, 0,2М натрий ацетаты, 0,3М сірке қышқылы.
III реагент: 0,4M Na2CO3шешім.
IV реагент: Форинт реагенті 5 рет таза сумен сұйылтылған.
V реагент: ферментті еріткіш: 0,1М натрий фосфатының ерітіндісі (рН 8,0).
VI реагент: тирозин ерітіндісі: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозин 0,2 ерітілгенM HCl.
Процедура
1. 0,5 мл реагент I 37 ℃ дейін алдын ала жылытылады, 0,5 мл фермент ерітіндісін қосыңыз, жақсылап араластырыңыз және инкубациялаңыз.37℃ 10 мин.
2. Реакцияны тоқтату үшін 1 мл реагент II қосыңыз, жақсылап араластырыңыз және 30 минут бойы инкубацияны жалғастырыңыз.
3. Реакция ерітіндісін центрифугалау.
4. 0,5 мл үстіңгі затты алыңыз, 2,5 мл реагент III, 0,5 мл реагент IV қосыңыз, жақсылап араластырыңыз және 37 ℃ температурада инкубациялаңыз.30 мин.
5. ОД660ОД деп анықталды1;бос бақылау тобы: 0,5 мл реагент V ферментті ауыстыру үшін қолданыладыOD анықтау үшін шешім660OD ретінде2, ΔOD=OD1-ОД2.
6. L-тирозин стандартты қисығы: 0,5 мл әртүрлі концентрациядағы L-тирозин ерітіндісі, 2,5 мл III реагент, 5 мл центрифуга түтігіндегі 0,5 мл IV реагент, 37 ℃ температурада 30 минут инкубациялаңыз, OD үшін анықтаңыз660L-тирозиннің әртүрлі концентрациясы үшін, содан кейін стандартты қисық Y=kX+b алынды, мұндағы Y – L-тирозин концентрациясы, X – OD600.
Есептеу
2: реакция ерітіндісінің жалпы көлемі (мл)
0,5: Фермент ерітіндісінің көлемі (мл)
0,5: хромогенді анықтауда қолданылатын реакция сұйықтығының көлемі (мл)
10: реакция уақыты (мин)
Df: Көп сұйылту
C: Фермент концентрациясы (мг/мл)
Анықтамалар
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Биофиз.Res.Коммун.(1971);44:513.
3. Хилз, Х.т.б.,EUR.J. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Сэмбрук Джet т.б., Молекулалық клондау: зертханалық нұсқаулық, 2-ші басылым, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Фигуралар
Інжір.1 Оңтайлы pH
100мМ буферлік ерітінді:pH6,0-8,0, Na-фосфат;pH8,0-9,0, Tris-HCl;рН9,0-12,5, Глицин-NaOH.Фермент концентрациясы:1мг/мл
2-сурет Оңтайлы температура
20 мМ К-фосфат буферіндегі реакция рН 8,0.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
3-сурет рН Тұрақтылық
25 ℃, 16 сағ 50 мМ буферлік ерітіндімен өңдеу: рН 4,5- 5,5, ацетат;рН 6,0-8,0, Na-фосфат;рН 8,0-9,0, Tris-HCl.рН 9,0- 12,5, глицин-NaOH.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
4-сурет Жылулық тұрақтылық
50 мМ Tris-HCl буферімен 30 минут өңдеу, рН 8,0.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
5-сурет Сақтау тұрақтыty at 25℃
